椎间盘退行性疾病的生物治疗策略

【关键词】  椎间盘 退行性疾病 生物

 1  引言

    当今世界，下腰痛发病率不断增加，是人群劳动能力丧失及下降的重要原因，其发病高峰年龄分布在20～50岁，产生了严重的社会经济影响。引起下腰痛的原因较多，而绝大多数医生和研究人员认为DDD是引起下腰痛的一个主要因素［1］。椎间盘是一个较为复杂的生物整体，大体分为纤维环(annulus fibrosus，AF)，髓核(nucleus pulposus，NP)和终板(end-plates，EP)。它呈现低细胞密度，包括纤维环细胞、髓核细胞以及可能存在的骨祖细胞［2］。引起椎间盘退变的因素包括机械负荷、遗传因素和营养作用等，这些因素通过影响椎间盘细胞的活力及生物合成能力，再加上应力作用，促使了椎间盘退变的发生和发展。

    目前DDD的手术以及保守治疗方法，能够缓解临床症状，但没有对椎间盘的固有功能进行修复，因此，寻找一种更符合生理、能够使组织再生的方法才能从根本上解决椎间盘退变的问题。而DDD的生物治疗正是这样一种很有潜力的治疗方法。

    2  DDD的生物治疗策略

    对于椎间盘退行性疾病，现阶段主要有四类生物治疗方法：向椎间盘直接注射细胞因子等生物活性物质；对椎间盘细胞进行体内基因治疗(直接基因疗法)；分离同源细胞进行培养，常常修饰后再重新植入；间充质干细胞的移植。各种方法的应用主要取决于对椎间盘细胞生物学的现有认识、椎间盘退变阶段以及安全因素。

    2.1  生物活性物质直接注射治疗

    活性物质在椎间盘退变中的直接应用通常采用直接注射的方法。对于生长因子，细胞因子或合成代谢酶等的直接注射研究体外试验较体内试验开展的多。

    2.1.1  骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)

    骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)也称为成骨蛋白-1(osteogenic protein-1，OP-1)，属于BMP家族成员。对兔椎间盘直接注射OP-1可以显著增加蛋白多糖合成，增加椎间盘高度［3］，进一步研究发现OP-1甚至可以抑制大鼠退变椎间盘模型中疼痛相关行为［4］。针对髓核摘除或化学融解术后出现的椎间隙狭窄的问题，有学者在由软骨素酶ABC造成的兔椎间盘退变模型中发现，注射重组人OP-1比对照组显著改善椎间盘的高度，持续到注射后16周，同时蛋白多糖含量也显著增加，但组织学检测上并没看到明显改善［5］。此外，人重组骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，  BMP-2)能在体外对老龄兔椎间盘AF细胞产生积极作用，细胞合成硫酸化氨基葡聚糖增多并分泌到基质中，蛋白多糖和II型胶原基因表达增加［6］。

    2.1.2  其他生物活性物质

    富含血小板的血浆(platelet-rich plasma，PRP)在体外能轻度提高猪椎间盘细胞的增殖能力，显著增加其合成蛋白多糖及胶原的能力，并促进蛋白多糖沉积。作者进一步将PRP用明胶水凝胶微球处理注射入退变兔椎间盘，发现其能减缓椎间盘退变并在NP和内层AF处发现蛋白多糖沉积增多［7、8］。而重组人转化生长因子(recombinant human growth differentiation factor-5，rhGDF-5)的作用在最近的动物模型中被证实，试验组椎间盘较对照组在影像学、组织学及蛋白多糖含量上有明显改善［9］。

    2.1.3  多种生物活性物质的联合应用

    Klein等进行的一个临床初期研究采用一种称为“椎间盘溶液”  (disc solution)的混合物(包含基质和辅助成分)注射到椎间盘，治疗后进行了13个月随访，患者降低了残疾评分(disability score)和疼痛视觉模拟评分(visual analogue pain score)。作者认为结果良好的原因可能是几种组分的联合注射使基质成分平行补充，多种生长因子同时诱导椎间盘修复［10］。但这个实验并不能说明注射的组分能维持在严重退变椎间盘中不漏出而产生持续作用。

    2.1.4  存在的问题

    直接注射疗法要求椎间盘细胞数目较多且能应答活性物质。人椎间盘细胞的生物合成能力及生存能力随着退变降低，仅仅在轻度退变时这种方法才可能有效，因而限制了其应用的广泛性，同时，通常直接注射法作用时间短，当注射物质耗竭或者弥散掉时作用就会停止。要解决这一问题，可以设想结合生长因子的缓释系统来持续释放活性物质，以获得持续治疗作用，这可能是未来的一个发展方向。另一方面，短暂的随访时间得出的结论限制了其应用于人类。

    2.2  基因治疗策略

    2.2.1  载体的选择

    通过遗传修饰椎间盘细胞来表达所需基因产物，可以延长活性物质供应的时间。基因的成功导入通常需要应用载体辅助。载体分为病毒载体和非病毒载体。非病毒载体因为转染细胞成功率低、基因表达率低、易丢失、作用时间短而少用。但最近有学者比较研究了几种不同的非病毒载体对椎间盘细胞的转染，发现LT1(Mirus公司生产并命名的基于组蛋白的载体)有较高的转染率和较小细胞毒性，有望成为体内转染人椎间盘细胞的载体［11］。

    病毒载体是转移基因的有效物质，针对椎间盘细胞，应选择能有效转染非分裂期静止细胞的病毒。1999年，Nishida等首先通过腺病毒载体转移有治疗作用的基因转化生长因子-β1到椎间盘细胞取得成功［12］，此后不断有应用腺病毒载体成功的例子，包括体内动物试验和体外转染人退变椎间盘细胞。为了克服腺病毒激活免疫系统这种缺点，有学者研究了一种新的腺相关病毒载体(adeno-associated viral vector,AAV)在退变椎间盘中的应用，发现它没有明显的细胞免疫并有效转来椎间盘细胞，这提示AAV可能是将来一个有价值的安全选择［13］。我国学者对重组杆状病毒载体对椎间盘细胞转染进行了实验，证明了它能在体外和体内有效表达搭载基因，并持续较长时间［14］。

    2.2.2  基因的选择

    对用于治疗的基因的筛选依然是有待研究的问题。目前研究的有治疗潜力的基因包括TGF-β，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs)，LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1，LMP-1)，SOX9和基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMP-1)等基因。LMP-l可以使体外椎间盘细胞合成BMP和蛋白多糖增加，而在活体兔椎间盘内注射可以提高合成代谢细胞因子BMP-2、BMP-7以及聚集蛋白聚糖的mRNA水平［15］。有实验证明联合几种活性物质基因进行转染，不仅有这几种因子在蛋白质合成中的累加效应而且显示出协同作用。应用抗分解代谢的因子是另一种新的基因治疗策略，通过抑制分解来降低基质退变。用腺病毒搭载TIMP-1体外导入分离的人退变椎间盘细胞，发现蛋白多糖含量增高［16］。Zhang等研究了腺病毒携不同BMP基因和SOX9基因转染牛AF和NP细胞，发现对于AF而言，携有BMP-2及BMP-13的腺病毒转染后蛋白糖合成增加最明显，胶原则是BMP-13和SOX9作用最强；对于NP，转染BMP-2和BMP-7最能促进蛋白多糖合成，而BMP-4及BMP-14对促胶原合成作用突出。这为治疗中对基因的选择作出了初步探索［17、18］。

    2.2.3  存在的问题

    椎间盘内的低细胞密度可能会妨碍足够数量细胞被转染，但同时这种封闭组织有助于注射的病毒载体达到高浓度，同时降低免疫反应。更重要的是，没有证据显示基因转染效率依赖于椎间盘退变程度，这是将来可以大规模应用这种技术的先决条件。然而，严重退变的椎间盘因营养缺乏及酸性环境，椎间盘细胞能否在有效时期内生产足量生长因子，细胞能否应答这些因子生产基质仍被质疑。

    2.3  同源细胞的补充治疗

    这种方法在于，首先分离椎间盘细胞体外进行培养，允许结合生物材料(组织工程)或者基因修饰再植入退变椎间盘。注射体外增殖的椎间盘细胞混悬液作为最直接的同源细胞治疗手段，也是迄今唯一用于临床的方法。临床研究中，大多数患者情况得到明显改善，但关于移植细胞的生存、表型以及生物合成能力的信息并不清楚［19］。

    2.3.1  同源细胞结合支架

    最初对单层培养的椎间盘细胞进行观察时，发现细胞表现出一致去分化形态学变化。但最近有试验发现成纤维生长因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)能维持单层培养的NP细胞的分化［20］。而在三维培养中的椎间盘细胞通常有保守的天然表型，并同天然椎间盘类似合成基质。以后的许多支架设计是被用来提供椎间盘细胞培养的三维环境。

    在移植前将椎间盘细胞在三维系统中培养而不直接移植，可能会增加细胞在体内环境中存活的机会。Sato等用一种支架名为atelocollagen结合兔AF细胞证实了这个方法［21］。随后很多研究人员将椎间盘细胞结合不同的支架诸如藻酸盐、胶原、壳聚糖等，修复动物退变椎间盘模型取得一定成功。最近Yang等利用纤维蛋白凝块复合NP细胞进行体外研究，发现细胞凋亡降低，基质中蛋白多糖含量增加，Ⅰ型胶原表达增加但SOX9基因表达降低，提示这种支架可诱导细胞纤维化分化［22］。

    2.3.2  基因修饰同源细胞

    这种生物治疗方法也可以称为间接基因治疗。毒搭载肉瘤病毒40转染人NP细胞进行兔退变椎间盘修复，发现转染的永生细胞系能明显从影像学、组织学上改善椎间盘的退变，蛋白多糖及胶原RNA含量较对照显著增加，随访26周细胞存活良好并未发现明显的免疫作用及致瘤风险［23］。而将人端粒酶导入体外培养的羊NP细胞，其提高了NP细胞的存活时间及增殖能力，并且持续合成细胞外基质(Ⅰ型及Ⅱ型胶原)达282 d［24］。但这个试验中却发现了染色体核型不稳定，提示安全性问题仍有待进一步研究。

    2.3.3  存在的问题

    从椎间盘组织获得足够靶细胞非常困难，脱出椎间盘的细胞回收是获取同源细胞的有利途径。分离髓核细胞需要打开AF，植入时也会损伤AF。同源细胞移植来修复椎间盘需要在植入细胞有益作用和植入对椎间盘结构带来损害之间达到精细的平衡。动物实验显示注射混悬液到兔椎间盘造成细胞从注射部位广泛漏出，而用细胞和纤维蛋白素原-凝血酶混合物注射时可减少漏出［25］。有学者研究人及猪胸椎椎间盘纤维环在不同直径的针注射下及受力状态下的渗漏情况，发现注射入邻近椎骨有骨质疏松的退变椎间盘的溶液可从终板处漏出。作者推荐用小于22号的穿刺针及小于0.2 ml的注射容积来防止漏出［26］。微创的髓核摘除术对大多数病人效果较好，术后是否需要移植细胞还有争议。自体细胞移植可以用减慢椎体融合术后邻近节段椎间盘退变的速度，但这也对一个仅有潜在退变可能的椎间盘造成影响。而另一个有待解决的问题是：植入退变椎间盘的细胞面临营养缺乏的危险，它们是否有足够营养而存活较长时间并持续修复椎间盘呢。

    2.4  基于干细胞的治疗

    2.4.1  干细胞的特性

    干细胞治疗通常采用成体干细胞，因为它们争议少，无克隆等伦理问题，同时也较小有致瘤风险。成体干细胞在正常机体中可以更新组织细胞，也在创伤修复中起作用。它们只有可塑性，能转化为非自身来源的组织。在骨外科，骨髓来源的间充质干细胞以及最近脂肪组织干细胞的应用被予以更多关注。

    人间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)是未分化的多潜能干细胞，在骨骼肌、骨髓、滑膜以及真皮中都有发现。MSCs具有高度可塑性和多向分化能力，容易获取且相对易掌控，成为骨外科理想的细胞及基因治疗的候选者。近来研究显示MSCs缺乏MHCl类抗原受体，提示它的应用具有免疫上的优势［27］。未分化状态的干细胞需要使其分化为软骨细胞或者类软骨细胞。把MSCs植入三维系统中培养能诱导转化为类髓核细胞表型［28］。将MSC同椎间盘细胞共同培养将促使MSC的椎间盘细胞表型，同时MSCs将促进椎间盘细胞的增殖及基质合成［29］。

    2.4.2  MSCs的应用探索

    许多试验探索了MSCs治疗椎间盘退变的效果。Sakai的研究，发现MSCs(包括GFP转染的MSCs)包埋入胶原凝胶中植入兔退变椎间盘模型中，显示出对髓核和纤维环结构的维持作用，阻止蛋白多糖减少，增加了椎间盘高度，植入细胞存活并表达髓核细胞特异的标志物［20、31］。用腺病毒携带SOX9基因转染MSCs结合多聚乳酸聚合物支架植入，也取得良好结果［32］。最近一项研究发现，MSCs能有效阻止甚至逆转兔椎间盘的退变，相同剂量的MSCs治疗轻度退变椎间盘效果较严重退变椎间盘好。低剂量的MSCs(5 000个)即可有效表现出再生作用，而过量将产生有害作用。同时这项研究中采用的鸟氨酸加压素水凝胶作为MSCs的支架能帮助重建髓核含水核心及维持椎间盘的高度［33］。

    2.4.3  存在的问题

    MSCs的应用潜力很大，但正式应用前仍有很多问题有待解决。尽管有数据显示分化的MSCs具有同天然髓核细胞的一致性，但并不能说明MSCs一定分化为椎间盘细胞，而且不清楚这种表型能否长期在椎间盘退变过程中稳定存在。另一个问题是新合成的基质是否具有适当生物力学性质，能够承受日常生活中的机械负荷。

    3  讨论和未来

    目前，生物治疗DDD的临床应用有许多问题等待解决。譬如，椎间盘退变病因学及细胞分子机制必须清楚，因为内源性致病因子的存在将致使任何治疗无效或者短暂有效；髓核细胞的确切表型和特性并不清楚，所以不能确定MSCs能分化为髓核细胞，这将影响到基于髓核的生物治疗；细胞治疗中植入细胞的营养问题；动物模型同人类椎间盘退变关联性并不清楚，以后的研究需要选用更类似于人椎间盘的动物模型，特别应考虑到细胞数量、密度、机械负荷等的相似；治疗同椎间盘退变程度紧密相关，有必要对椎间盘退变分期作出定义，从而制定不同阶段采用的生物治疗标准。然而，随着生物治疗的发展，可以期待这种以促进受损组织再生恢复其功能的方法最终给患者带来福音。

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作者单位：四川大学华西医院骨科，四川成都