深低温冷冻异体肌腱移植的组织学和生物力学研究

【摘要】  ［目的］探讨深低温冷冻同种异体肌腱替代自体肌腱进行移植治疗肌腱缺损的可行性及移植后异体肌腱的形态学和生物力学性能的动态变化。［方法］采用兔跟腱缺损修复模型，经深低温冷冻的同种异体跟腱为实验组，自体跟腱移植为对照组，分别在术前及术后2、4、8周时对实验组同种异体跟腱及对照组自体跟腱进行大体观察、组织学检查和生物力学测试。［结果］同种异体跟腱与自体跟腱在移植前和移植后2、4、8周时其大体观察、组织学检查和生物力学测试等各项指标均无明显差异，显示同种异体跟腱和自体跟腱有相类似的结构及愈合过程。另外，同种异体跟腱在移植后其力学性能（除衰竭应变外）均比移植前明显降低。随时间推进有上升的趋势，但8周时仍明显低于移植前水平。［结论］深低温冷冻同种异体肌腱可替代自体肌腱应用于移植修复肌腱缺损。同时，由于移植后肌腱力学性能明显下降，需给予适当保护，防止过度牵拉而导致衰竭。

【关键词】  肌腱; 同种异体移植; 深低温冷冻; 组织学； 生物力学

 Histological and biomechanical study of deepfrozen allogenetic tendons∥XU Guanghui, SUN Kang, XU Qiang,et al.Department of Orthopedics, Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University Medical School, Yantai, 264000，China

    Abstract：［Objective］To explore the allograft, as a substitute for autograft, whether can be used to repair  the defect of the tendon and restore the stability of joint and the dynamic biomechanical changes of allograft  after transplantation.［Method］Deepfrozen allogeneic achilles tendons of rabbits were used as treatment group, and autogenous ones as control. The achilles tendon defects of back limbs were repaired by allograft and autograft separately. The macroscopic, microscopic observation and biomechanical test were performed   on both of them before transplantation and in 2, 4 and 8 weeks after transplantation.［Result］It was showed that there were no differences in macroscopy, microscopy and mechanical strength between allograft and autograft both before and after transplantation. They may have experienced the similar healing course. The mechanical strength of allograft (except failure strain) was reduced significantly after transplantation. But it had a rising trend with time passing, although it was fairly low in 8 weeks compared with the normal such as maximum load.［Conclusion］The results demonstrate that the deepfrozen allograft can substitute for autograft in repairing the tendon defect, and because of the weakness of allograft after transplantation, it needs appropriate protection to prevent failure by excessive strain in early stage.

    Key words：tendons;  homologous transplantation;  deepfrozen;  histology;  biomechanics

   　肌腱韧带损伤是骨科常见疾病，治疗中经常需要应用肌腱移植来修复肌腱缺损，重建关节的稳定性等。同种异体肌腱作为自体肌腱的替代，来源广泛，经深低温冷冻处理后其抗原性大大降低，并可长期保存，在此基础之上建立深低温肌腱库，可为临床修复重建提供大量方便实用的移植材料［1］。本实验对深低温冷冻异体跟腱移植修复跟腱缺损进行组织学和生物力学的研究，以明确异体肌腱替代自体肌腱的可能性和相关的组织学及生物力学变化。

    1  材料和方法

    1.1  仪器和设备

    －86℃深低温冷冻冰箱（美国Forma Scientific）

    DCS－25T电子万能试验机和3033型函数记录仪（烟台大学提供）

    1.2  动物分组

    　　由烟台绿叶制药实验动物中心提供健康成年新西兰兔27只，均为雄性，体重1.8～2.2 kg，平均2 kg。随机分为2组，1组为供腱组，共9只，用于提供移植用异体跟腱；另1组为移植组，共18只，进行移植实验。

    1.3  深低温冷冻同种异体肌腱的制备

    　　取供腱组兔9只，用3％戊巴比妥钠溶液30 mg/kg体重行耳缘静脉麻醉，严格无菌操作，将双侧跟腱切下（上至腱腹交界处，下至止点上5 mm，长度约3～4 cm），共取跟腱18条。生理盐水冲洗后放入无菌聚乙烯袋中密封包装，普通冰箱中（－20℃）6 h后置入深低温冰箱（－75℃）冷冻2周即可应用。使用前室温下缓慢复温12 h，30℃生理盐水5 min即可。

    1.4  手术方法

    　　取行移植术的兔共18只，一侧跟腱切下后的缺损采用深低温冷冻异体跟腱移植修复，另一侧缺损由所切下的对侧的新鲜自体跟腱移植修复作为对照。哪侧为异体移植组随机选取，术后做好标记。术后双后肢行40°半屈曲位石膏管型固定。取手术切下的新鲜跟腱6根立即行组织学检查和力学测试，另取6根按前法冷冻处理后也行组织学检查和力学测试。

    1.5  术后处理

    　　所有动物均在烟台绿叶制药实验动物中心按标准饲养，昼夜正常规律。术后未发现动物不明原因死亡、伤口感染、自残、跖底溃疡及石膏外固定脱落等现象。术后满3周后去除石膏外固定，任其自由活动。在术后2、4、8周时，分别随机取6只移植组动物用于观察实验结果。

    1.6  实验观察指标

    1.6.1  大体观察  包括兔的行走情况、双后肢的活动幅度、肌力及肌腹－肌腱－骨的连续性和移植跟腱及其吻合口的形态学的肉眼观察结果。

    1.6.2  组织学检查  标本取自新鲜跟腱、未移植的深低温冷冻跟腱和移植后不同时期的自体及异体跟腱，及移植后8周时自体及异体跟腱吻合处组织，行病理切片，HE染色，观察不同时期和不同种类的跟腱及8周时吻合口的组织学变化。

    1.6.3  生物力学测试［2］  试样保持湿润状态，室温为25℃，实验步骤如下：

    A. 用游标卡尺测量试样的直径，以计算出横截面积

    B. 进行预调，对试样进行反复加载0～20 N共10次

    C. 测定两夹头间距离为拉伸前的原始长度

    D. 实施匀速单轴拉伸试验，速度100 mm/min，直至试样完全衰竭（拉伸段不包括吻合口）

    E. 试验机记录下最大载荷，函数记录仪记录下载荷—变形曲线

    　　根据试验数据可计算出肌腱的各项力学性结果，公式如下：衰竭应变＝拉伸长度/原始长度；最大拉张强度＝最大载荷/横截面积；弹性模量＝应力/应变（取自线性区）。

    1.7  统计学处理

    1.7.1  自体和异体跟腱各项力学性能的数据表示用均数±标准差，采用SPSS 12.0统计软件处理，比较采用t检验，以P<0.05为差异有显著性。

    1.7.2  异体跟腱在移植前后的各项力学性能的比较采用SPSS 12.0统计软件处理，方法采用单因素方差分析，有差别时再采用q检验，以P<0.05为差异有显著性。

    2  结  果

    2.1  大体观察结果

    2.1.1  兔跟腱在移植后不同时期的体检情况  2周时兔不能正常行走，双后肢拖行，可触及皮下跟腱，有连续性。双后肢活动幅度均较正常明显降低，肌力低于正常。双后肢间无明显区别。4周时兔可行走，但步态异常，速度慢。皮下肌腱触及可推动，肌腹腱连续性存在。双后肢活动幅度仍较正常降低，肌力较前增强。双后肢间无明显差别。8周时兔可正常行走，步态无明显异常，速度仍较正常组慢，可轻松地推动皮下的跟腱，连续性好。双后肢活动幅度和肌力与正常对比无明显差别，双后肢间无明显差别。

    2.1.2  移植后不同时期的2种跟腱的形态学肉眼观察结果（表1）

    2.2  组织学观察

    移植前和移植后不同时期的组织学观察结果（表2、图1）。表1  异体跟腱和自体跟腱在移植后不同时期的大体观察结果

    2.3  生物力学测试结果

    2.3.1  同种异体跟腱和自体跟腱的力学性能比较结果（表3）

    深低温冷冻同种异体跟腱和自体跟腱相比，在移植前、移植后2、4、8周时各项力学性能均无显著差异（P>0.05，t检验）

    2.3.2  异体肌腱在移植过程中其力学性能随时间而发生变化

    最大载荷：移植后各组的最大载荷均明显低于移植前（A组），移植后各组间无明显差异。

    衰竭应变：移植后2周组大于移植前组有高度显著性，其余各组间无显著差异。

    弹性模量：移植前组明显高于移植后各组，而移植后各组有随时间递增的趋势。

    最大拉张强度：移植前组明显高于移植后2、4周组，但到8周时却恢复到移植前的水平。表2  不同时期的同种异体跟腱和自体跟腱的组织学观察表3  异体跟腱和自体跟腱的力学性能测定值比较 图1a.为新鲜肌腱（纵向，HE，100×）；图1b.为同种异体肌腱（右）及腱周组织（左）（纵向，HE，200×）；图1c.为异体跟腱移植后2周，左为腱外膜细胞增生（纵向，HE，200×）；图1d.为异体跟腱移植后4周，有多量细胞增生、胶原合成（纵向，HE，200×）；图1  E为异体跟腱移植后8周，左为疏松的腱周组织（纵向，HE，100×）；图1f.为异体跟腱移植后8周时愈合口(细胞数较多)（纵向，HE，200×）。

　　3  讨  论

    　　肌腱移植在重建外科中应用广泛，可修复肌腱缺损，重建关节稳定性，修复屈肌腱的滑车，修复肌腹撕裂及用于软组织辅助的关节成形术［1～3］。肌腱来源有自体肌腱、人工肌腱、同种异体肌腱和异种肌腱等数种。自体肌腱无免疫原性，是移植的金标准，但肌腱来源有限，供腱处的形态功能可受影响，而且手术时间延长增加病人的痛苦，有些肌腱无合适的自体供体。人工肌腱存在生物相容性和与受体腱不愈合的问题。异种肌腱存在免疫原性问题。同种异体肌腱作为一种新方法已得到初步临床应用。常用保存方法有深低温冷冻法、冻干法、化学物质处理法等。无论哪种保存方法，目的都是为了减少抗原性，保持移植材料的完整性，保证无菌。深低温冷冻法比较好地符合了这个标准。国内外大量实验、临床研究表明深低温冷冻法确实可降低肌腱的抗原性［2］。本实验中同种异体跟腱在移植后的组织学检查与自体跟腱无显著区别，未发现明显免疫排斥反应，也是抗原性降低的佐证。

    　　同种异体肌腱和自体肌腱一样，在移植后要经过一个愈合过程，这包括吻合口的连接，肌腱的再血管化、新生胶原的产生和陈旧胶原的分解、应力塑形等步骤［2,4］。经过塑形期后，异体肌腱在组织学和生物力学上与正常肌腱便无明显区别。Drez等［2］的山羊动物模型实验中也显示异体腱在前12周已再血管化，前26周内可达到其所替代组织的功能，与自体腱的愈合过程相似。本实验整个移植过程中，异体腱与自体腱的组织学相比，表现为细胞反应稍重，新生胶原量较多，排列稍紊乱，腱束内部有小的局灶性坏死区。但移植后各时期兔双后肢的活动幅度、肌力、腱连续性无明显区别，8周时异体腱的表面血管网已同自体组一样，腱束内胶原纤维排列规则，吻合口处也和自体腱一样。所以作者认为，异体腱和自体腱经历大致相似的愈合过程。

    　　应用肌腱移植体时要考虑其力学性能。本实验测定使用－75℃深低温冷冻处理的同种异体跟腱和新鲜跟腱相比，其各项力学性能均无明显差异，从而明确了深低温冷冻保存不会改变腱的力学性能。本实验同时也显示在移植后2、4、8周时，异体跟腱仍保持和自体跟腱相同的力学强度，进一步说明同种异体肌腱在力学性能上完全可以取代自体肌腱。为进行临床实验提供了重要的理论基础。

    　　深低温冷冻异体肌腱在移植术后随着组织学的变化其力学性能要经过一个动态变化的过程，最终恢复到正常的力学强度。本实验移植早期（8周内），异体肌腱由于正在进行血管化，有大量成纤维细胞增生，胶原代谢旺盛，分解代谢较强而合成的新生胶原由于排列欠规则，从而导致力学强度的降低。最大载荷在移植后2周时仅为移植前的63.7%，4周时为70.9%，8周时为73.9%。随时间推移，各项力学指标似有逐渐增大的趋势。其中，最大拉张强度在8周时甚至恢复到了移植前的水平。由于异体肌腱主要依靠外源性愈合，所以最重要的是术后早期活动，防止粘连，促进新生胶原沿应力方向塑形。同时由于术后早期肌腱的力学强度明显下降，过度牵拉后容易引起松弛或断裂，必须在术后早期给以适当的保护，同时避免高张力的活动［5］。

【参考文献】
  ［1］ 孙 康，王立德，张羽飞,等. 同种异体材料移植重建膝关节交叉韧带［J］. 中国矫形外科杂志，2001，2：174-176.

［2］ Drez DJ Jr, Delee J, Holden JP, et al. Anterior cruciate ligament reconstruction using bonepatellar tendonbone allografts: a biological and biomechanical evaluation in goats［J］. Am J Sports Med, 1991, 19: 256.

［3］ 黄长明，沈瑞群，王建雄,等. 关节镜下解剖等长重建技术在重建前交叉韧带中的应用［J］. 中国矫形外科杂志，2007，24：1844-1847.

［4］ 孙 康，汤继文，徐 强,等. 同种异体组织重建关节韧带临床疗效的初步观察［J］. 中华创伤杂志，2004，10：585-588.

［5］ 张明学，周 密，刘 静,等. 关节镜下自体腘绳肌腱重建前交叉韧带的康复和护理［J］. 中国矫形外科杂志，2006，18：1435-1438.

作者单位：1.青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院骨科，烟台；2.青岛大学医学院附属医院关节外科，青岛