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【关键词】 组织工程学 再生椎间盘
因创伤、感染、结核及肿瘤等原因引起的腰椎间盘退变逐渐增多，其一旦发生，难以逆转。传统治疗虽然能缓解临床症状，遗憾的是无法解决根本问题，甚至引发并发症。组织工程学治疗策略的兴起，为椎间盘退变疾病开辟了新的研究领域，已受到人们的关注与重视，并为椎间盘再生治疗带来了希望［1］。本文就有关该领域的相关研究作一综述，重点探讨有关的种子细胞、相关生长因子、载体及构建等方面的研究进展。
1 椎间盘的功能及组织特点
椎间盘是机体脊柱承载系统中最复杂的部分，具有减缓冲击、吸收震荡及提供稳定性等重要力学功能。椎间盘的结构特性依赖于其组成成分的性质。椎间盘组织承受人体躯干及上肢的重量，劳损较其他组织多。长期的承重过程对椎间盘细胞的形态、表型、增殖及胶原和蛋白多糖等基质的合成都产生重要影响，从而改变椎间盘结构，使其发生退行性改变。椎间盘是人体最大的无血运组织，其供养血管在出生后8个月就闭合，营养主要靠软骨终板的渗透作用，因而极易发生退变。加上髓核和纤维环细胞的体内分裂增殖能力很差，椎间盘组织自身再生(self-regeneration capacity)和修复能力有限，这些特点均决定了椎间盘退变难以自身逆转的事实。
2 椎间盘组织工程基本问题研究
2.1 种子细胞
种子细胞为构建工程化组织最重要的物质。目前用于椎间盘细胞移植及工程化组织构建的细胞来源如下。
2.1.1 髓核细胞
髓核细胞主要表达具有软骨表型特征的蛋白多糖和Ⅱ型胶原，其增殖能力较弱，培养过程要求严格。髓核细胞的培养方法来源于软骨细胞培养方法，髓核细胞由单层培养移至三维环境时，会恢复以前的特征，可表达体内髓核细胞的一些基因及形态学特征，此种细胞能供椎间盘组织的移植修复。
2.1.2 纤维环细胞
椎间盘纤维环外层主要为类成纤维细胞，表达I型胶原，维持纤维环的张力。纤维环内层为类软骨细胞，表达具有软骨表型的II型胶原，承受椎间盘压力。纤维环细胞的培养与髓核细胞的培养略有不同，边缘纤维环细胞的耗氧率低于髓核细胞，另外，产生的纤维环富含I型胶原而髓核富含II型胶原，与体内椎间盘结构相似［2］。
2.1.3 间充质干细胞
Richardson［3］将骨髓间充质干细胞与髓核细胞共同培养，验证了间充质干细胞治疗椎间盘退变的可行性。间充质干细胞遗传背景稳定，可逃避异种抗原识别，易于扩增数量，应用前景广阔［4］。近年来，Li［5］分离培养出脂肪间充质细胞，其能在体外稳定扩增。这些细胞大部分来源于中胚层或间充质，可向软骨细胞、肌肉细胞和成骨细胞等分化，这为寻求组织工程化椎间盘的种子细胞新来源奠定了研究基础。
然而，干细胞具有多向分化的特点，如何诱导所分离的干细胞向椎间盘细胞分化，如何检测细胞蛋白多糖与胶原蛋白的比率来划分髓核细胞与其它细胞的生物学特征，目前还缺乏了解。故干细胞应用于组织工程椎间盘的构建研究尚缺乏长期和细致的工作。
2.2 载体材料
载体材料是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响着所构成的组织形态和功能。而支架表面的空间拓扑结构对细胞形态、黏附、定向生长及生物活性有重要影响，它包括天然与人工合成两种材料。
2.2.1 藻酸盐
作为一种原始的组织工程载体，由于存在制备工艺缺陷，藻酸盐常与其它材料复合。Shao［6］将纤维环细胞接种在藻酸盐／几丁质复合支架，扫描电镜显示细胞生长良好、细胞外基质丰富。这证实了藻酸盐／几丁质复合支架能负载纤维环细胞的可行性及应用于组织工程化椎间盘构建的潜力。
2.2.2 小肠粘膜下层
Le Visage［7］采用猪小肠粘膜下层作为体外椎间盘构建的自然衍发基质，将人纤维环及髓核细胞种植培养3个月，结果发现糖胺聚糖含量升高、I型、Ⅱ型、X型胶原及聚集蛋白与Sox9基因表达强烈。认为小肠粘膜下层可作为椎间盘再生的支架。
2.2.3 壳聚糖
Mwale［8］构建了不同纯度的脱乙酰壳聚糖(2.5%～10%)／京尼平(Genipin，一种环烯醚萜类化合物，5%～20%)支架复合牛椎间盘细胞，取得了最佳培养效果。Di［9］等指出壳聚糖具备人为控制的海绵状孔隙结构特征，利于骨形态发生因子、生长因子和各种药物的控释，并能促进接种细胞生长。
2.2.4 明胶
猪髓核细胞植入明胶、脱钙骨基质及聚乳酸化合物混合支架中培养，结果显示培养后的细胞代谢活跃，分泌大量I、Ⅱ型胶原［10］。在明胶与6-硫酸软骨素共聚物支架对人髓核细胞培养影响的研究中，Yang［11］也证实了同样结果。
2.2.5 胶原
Sakai［12］对接种在三种不同的胶原凝胶与藻酸盐的人髓核细胞系HNPSV-l进行比较，发现在胶原凝胶培养的细胞DNA含量较藻酸盐组高，胶原凝胶产生的髓核组织具备良好的含水性及蛋白多糖存留，这说明胶原凝胶能进行体外三维培养人髓核细胞系的可行性，并作为具有潜力研发的生物支架。
2.2.6 聚磷酸钙(calcium polyphosphate，CPP)
髓核细胞及分离的软骨终板接种于多孔CPP表面，制备三相构建物(triphasic construct)，培养至8周，通过组织学、形态学及DNA含量、蛋白多糖、胶原测定和力学性能等分析，显示在CPP表面形成了髓核及软骨终板样组织，并具有近似髓核的力学性能。研究提示构筑具备软骨终板样表层的复杂成分的构建物有望改善骨替代物—椎间盘界面的组织特性［13］。
2.2.7 富血小板血浆(plateletrichplasma，PRP)
Akeda［14］发现PRP能刺激椎间盘细胞增殖，纤维环细胞较髓核细胞对PRP反应明显，并能上调蛋白多糖及胶原合成。Akeda认为局部应用PRP可刺激椎间盘细胞修复，自体血液是刺激细胞再生椎间盘所需生长因子的来源之一。
2.2.8 聚合物材料(polymer materials，PLM)
Revell［15］将分离培养的猪自体骨髓干细胞种植在两种透明质酸可注射性聚合物中(HYAFF-R与HYADD-R)，并注射到腰椎髓核摘除部位，术后6周组织学发现治疗组可阻止纤维组织替代及终板破坏，促进椎间盘再生。Wildal［16］制备聚乳酸／生物玻璃合成薄膜(PDLLA／45S5)来培养纤维环细胞，扫描电镜、接触角测试证实这种合成薄膜生物相容性良好，无细胞毒性，可作为纤维环细胞生长的适宜载体，促进硫酸糖胺聚糖及胶原等细胞外基质的合成。
目前为少数学者仍采用藻酸盐作为基载体材料，所合成的框架材料不具备与椎间盘相似的压缩、拉伸以及黏弹特性，直接应用于组织工程椎间盘的构建还存在理论上的缺陷。尽管尚无公认最合适的载体材料，但可降解性高分子仿生支架、天然／合成杂化(Hybrid)材料渐成为载体研发的方向，仍需要今后进一步研究。
2.3 生长因子
2.3.1 转化生长因子-β(TGF-β)
TGF-β具有调节细胞生长、分化、凋亡和细胞外基质合成的功能，骨形态发生蛋白(BMP)是TGF-β的超家族成员之一，BMP-7(OP-1)属BMP家族之一，能促进软骨细胞合成II型胶原和蛋白多糖。Chen［17］观察到TGF-β1联合PRP，通过Smad通路，激活p-Smad2／3，促进髓核细胞再生：RT-PCR检测SoX9基因、Ⅱ型胶原及聚集蛋白的mRNA表达上调，糖胺聚糖含量在第7 d达高峰并持续到第9 d。
2.3.2 胰岛素样生长因子(1GFs)和血小板衍生生长因子(PDGF)
具有维持细胞表型、促进细胞外基质合成、抑制细胞凋亡及促进细胞增殖效应。
2.3.3 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)
目前对bFGF和EGF的研究主要集中在退变椎间盘中的作用，退变椎间盘细胞因缺乏FGF和EGF及其受体，导致细胞外基质成分丢失。FGF分为碱性和酸性成纤维细胞生长因子，它们作用于共同的受体并具有高度结构同源性(55%)，通过自分泌和旁分泌方式与其两种受体结合。
2.3.4 其他生长因子
生长分化因子-5(growth and differentiation factor-5，GDF-5)，最近Cui［18］证实GDF-5能抑制基质金属蛋白酶-3基因表达，但促进蛋白聚糖与II型胶原基因表达，硫酸糖胺聚糖含量增加，这提示对椎间盘退变尽早干预有可能中止或延缓疾病进程。
希望寻求合适的因子来逆转椎间盘退变，提供临床应用的可靠治疗模式的同时，也为我们提出了新的挑战，目前研究重点在于椎间盘退变模型中多种生长因子相互作用机理的研究。
3 组织工程化椎间盘的构建研究
细胞的体外扩增是体外构建组织工程化椎间盘的关键因素。由于椎间盘细胞体外单层培养时增殖极为缓慢，原代培养常需要2～3周，多次传代后无法维持细胞特异性分化表型。如何提高椎间盘细胞的增殖能力，短时期内获得充足的种子细胞并维持其表型显得至关重要。
在细胞培养筛选模式方面，Richardson［19］将人MSCs种植于温度敏感的水凝胶-壳聚糖-甘油磷酸酯中(C／Gp)，并对种植于同样载体的髓核细胞及关节软骨细胞的基因与蛋白表达进行评估。软骨细胞标记基因的表达分析证实MSCs表型分化具备关节软骨细胞及髓核细胞的表型相似性，PCR分析显示缺乏成骨标记基因表达及X型胶原标志基因表达，MSCs以比例方式分泌蛋白多糖与胶原，这更像髓核细胞。
在构建模式方面，Richardson［20］尝试用三维聚L乳酸(PLLA)支架作为体外构建髓核的载体，将MSCs培养为关节软骨样细胞，经实时定量PCR检测证实具有髓核标记基因，并将其接种于多孔三维聚L乳酸(PLLA)支架中，髓核基质标记基因出现表达及沉积，尤其为聚集蛋白与II型胶原基因。Richardson认为将人MSCs种植于多孔、三维生物可降解性聚合支架中，有望实现再生人椎间盘。
构建工程化椎间盘的研究涉及两个方向：种子细胞及载体的选择和处理。前者包括自体或异体的椎间盘细胞，各种干细胞等；后者为基因工程及其它方法进行调控处理。更具研发潜力的仍然是载体与种子细胞的处理方式。椎间盘细胞的动态三维培养，某种程度解决了细胞数量不足和分布不均的问题，可能是今后构建研究的一个主要方向。
4 组织工程化椎间盘的基因治疗研究
许多学者尝试将转基因细胞作为组织工程化椎间盘的种子细胞，选择合适目的基因是基因治疗的重要环节。目前用于促进细胞的合成代谢基因有TGF-β1、LMP-I、BMP-2、Sox9、IGF-I等，载体多选腺病毒载体。
VadalhG［22］以绿色荧光蛋白编码基因的腺病毒载体转染人髓核细胞，转染后第1 d的细胞在含四环素的培养基中培养，第3 d，除去四环素，细胞继续培养，结果显示在应用四环素期间，GFP表达减弱，相反，在非四环素的培养阶段，GFP恢复表达。Vadalo认为四环素可关闭GFP表达，随后又恢复其表达，这种关闭诱导系统能作为调节转基因表达避免其毒性的一种有效手段。
IL-1可改变基质生物学行为，使其向椎间盘退变发展。IL-l是启动椎间盘退变中基质降解的关键细胞因子。最近体外研究发现，应用基因转染方法能抑制椎间盘退变过程中IL-1介导的反应［23］，尤其运用基因修饰的工程化组织构建方法将IL-lRa引入到退变的椎间盘部位，能减少基质降解、延缓退变。借助基因治疗模式直接运载IL-1Ra，能抑制椎间盘中的基质降解。这些结果揭示了椎间盘退变基因治疗的广阔前景，为椎间盘种子细胞的体外调控提供了新的研究途径。
5 椎间盘组织工程学的研究展望
总之，组织工程学策略为椎间盘再生治疗提供了可能，结果令人鼓舞。但对椎间盘细胞表型研究尚不充分，更多特异性表型尚不清楚。建立表型稳定的体外细胞模型存在诸多困难，尽管在载体结构和细胞培养方法改进等方面取得了较大进展，但构建完整的工程化椎间盘进行体内移植的研究报道不多。如何面临细胞扩增后的老化问题，基因工程介导的调控方法是否为最佳选择，这对用组织工程及基因重组技术构建椎间盘提出了挑战。然而，随着组织工程学的发展及人们对脊柱基础研究的深入，完全有希望应用组织工程技术为脊柱疾患的治疗观念和治疗模式带来新的契机。
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作者单位：天津医科大学总医院骨科，天津