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首页医源资料库在线期刊中国矫形外科杂志2009年第17卷第2期

Bh靶向TNFα的反义寡核苷酸治疗人工关节磨损微粒诱导的骨溶解的实验研究

来源:《中国矫形外科杂志》
摘要:【摘要】[目的]研究单次皮下注射靶向肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor,TNFα)的反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,ASO)治疗人工关节磨损微粒诱导的骨溶解的作用,探讨用于防治人工关节置换后假体松动的可能性。[方法]采用小鼠颅骨建立微粒诱导的骨溶解的动物模型,分为5组:第1组为假手术组,......

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【摘要】  [目的]研究单次皮下注射靶向肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNFα)的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)治疗人工关节磨损微粒诱导的骨溶解的作用,探讨用于防治人工关节置换后假体松动的可能性。[方法]采用小鼠颅骨建立微粒诱导的骨溶解的动物模型,分为5组:第1组为假手术组,第2组为阳性对照组,第3组为低剂量治疗组,第4组为高剂量治疗组,第5组在第四组处置的基础上再次给予TNFα。通过甲苯胺蓝染色观察颅骨表面骨吸收陷窝的数量并测量其面积,通过抗酒石酸的酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色来观察破骨细胞并进行计数,通过定量试剂盒对TRAP的活性进行定量研究。同时采用RTPCR和ELISA的方法检测TNFα的表达。[结果]靶向TNFα的ASO可以显著下调靶基因的表达,对微粒诱导的骨溶解有明显的抑制作用。骨吸收陷窝的数目与面积以及破骨细胞的数量均较阳性对照组有明显下降,定量研究显示TRAP的活性也有明显的下降。这种改变与ASO的用量呈明显的依赖性,高剂量组的治疗结果接近于假手术组。再次给予TNFα可以逆转这种抑制效果。[结论]靶向炎症因子TNFα的反义核酸通过抑制TNFα表达,抑制了由微粒诱导的骨溶解。为防治人工关节置换后假体松动提供了一种很有应用前景的治疗策略。

【关键词】  反义核酸; 骨溶解; 松动; 关节置换; TNFα

 Antisense oligonucleotides targeting TNFα suppress on CoCrMo particleinduced osteolysis∥WANG Rui,GUO Ting,ZENG Xiaofeng,et al.Nanjing General Hospital of Chinese PLA Nanjing Military Command,Nanjing,China 210002

    Abstract:[Objective]To investigate the effect of a single subcutaneous dose of an antisense oligonucleotide (ASO) on particleinduced osteolysis.[Method]The murine calvaria osteolysis model was utilized in ICR mice. Bone resorption was measured with the toluidine blue staining. Osteoclasts were detected by tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining assay and were quantified by a TRAP quantification kit.[Result]Bone resorption was 0.347 ± 0.09 mm2 in animals with particle implantation, and decreased to 0.123 ± 0.05 mm2 and 0.052 ± 0.02 mm2 after ASO treatment in low and high doses, respectively. The bone resorption was reestablished in animals given an additional TNFα. The number of osteoclasts in animal calvaria treated with ASO was reduced obviously compared with those untreated animals and the quantification results indicated that about 90% osteoclastgenesis was suprressed by the ASO. Additionally, the osteoclastgenesis was reestablished by the addition of TNFα.[Conclusion]An antisense oligonucleotide targeting an inflammatory factor, TNFα,has been to suppress the osteolysis induced by particle for the first time. This new finding holds a great promise. It is a therapeutic strategy for the component loosening.

    Key words:antisense oligonucleotides;  osteoclast;  loosening;  replacement;  tumor necrosis factor

   假体无菌性松动是人工关节置换术后最常见的远期并发症,是导致翻修手术的主要原因,而假体周围骨溶解则是假体无菌性松动的主要原因。对于假体周围骨溶解的机制,比较一致的看法是,破骨细胞前体细胞由于吞噬了磨损微粒,引发了某些细胞因子反应,进而引起局部的骨溶解。TNFα就是其中的一个主要的细胞因子,既往的研究显示TNFα不仅可以直接通过增加破骨细胞前体细胞增殖分化,增加成熟的破骨细胞数量,还可以激活破骨细胞,使其破骨能力增强,因此下调TNFα表达很可能有助于阻止微粒诱导的骨溶解的发展。本实验采用小鼠颅骨建立微粒诱导的骨溶解的动物模型,研究了单次皮下注射抗TNFα的反义寡核苷酸(ASO)对微粒诱导的骨溶解的作用,为防治关节置换后的假体无菌性松动打下基础。

    1  材料与方法

    1.1  材料与动物

    反义寡核苷酸编号为ISIS 25302,  由南京大学生物医药重点实验室保存。CoCrMo合金粉末由人工关节制造商美国DePuy公司(Raynham,MA,USA)惠赠,该粉末中90%的微粒<5 μm,50%的微粒<2 μm,平均粒径为1.43 μm(直径范围0.05 μm~7.82 μm)。LAL(Limulus Amebocyte Lysate,内毒素鲎)试剂盒购自于美国Charles River Lab公司。TRAP定量试剂盒购自于南京建成生物技术公司。TNFα的ELISA定量试剂盒购自于上海晶美生物技术公司。清洁级6~8周龄的ICR雌性小鼠由南京军区比较医学科动物实验中心提供。

    1.2  CoCrMo合金粉末处理

    为防止细菌及残留内毒素引发炎症,合金粉末经70%酒精中于室温下反复超声清洗3次,每次30 min,每次均将洗涤后的酒精弃去。将清洗完的颗粒置于70%酒精中浸泡48 h,以无菌PBS(phosphate buffered saline,pH7.2-7.4)洗涤3遍后,采用LAL试剂盒对样品进行定量检测。根据说明书所述方法进行操作,以0.25 EU/ml为检测标准。结果为阴性后将粉末无菌条件下烘干,保存于无菌容器中4℃保存备用,使用前配制成3×109/ml个微粒的悬液。如不合格,则重复上述过程,直至达标为止。

    1.3  实验分组

    取清洁级6~8周龄的ICR雌性小鼠35只(由南京军区比较医学科动物实验中心提供),随机分成5组,每组7只,根据预实验结果给药:组1,假手术组;组2,阳性对照组,只接受微粒的作用;组3,低剂量治疗组,给予微粒术后,一次性局部皮下注射ASO(5 μg/只);组4,高剂量治疗组,给予微粒术后,一次性局部皮下注射ASO(10 μg/只);组5,TNFα再次给予组,操作同组4,但于术后7 d开始接受TNFα蛋白的局部皮下注射治疗(20 ng/只)连续5 d。参考Knocha M等[1]的方法建立动物模型,以氯氨酮(70~80 mg/kg)和氟哌利多(5~7 mg/kg)混合腹腔注射麻醉小鼠,麻醉成功后将其俯卧位固定于操作台上,术区备皮后,以0.5%的碘伏消毒,铺无菌巾单。取小鼠头部前正中矢状切中,上起双耳连线中点,下止于双眼连线中点,长约10 mm。切开皮肤,显露10 mm×10 mm大小的骨膜,将Co-Cr-Mo合金粉悬液(含微粒3×109/ml)30 μl均匀地洒于骨膜上后,连续锁边缝合切口,术后腹腔注射青霉素防止感染。按上所述给予ASO和TNFα。手术由同1名外科医师于1 d内完成,实验中所用的所有溶液器械,均进行高压蒸汽灭菌,手术过程严格按照无菌操作。

    1.4  蛋白定量测定

    术后2周,以颈椎脱臼法处死小鼠,将颅骨表面的筋膜和骨膜组织取下,以天平称取相同重量的组织,在10倍生理盐水中高速匀浆后,高速离心取上清。采用TRAP定量试剂盒检测上清液中的TRAP活性,采用TNFα的ELISA定量试剂盒测定上清液中的TNFα蛋白含量。及均按试剂盒说明书进行操作,计算7份样本的平均值。同时采用考马斯亮蓝比色法(Bradford法)确定标本中总蛋白的含量,用于标化ELISA、TRAP定量的检测结果。

    1.5  RT-PCR

    取下颅骨表面的筋膜和骨膜组织后,立即置于液氮中冷冻,按TRIZOL试剂盒说明书提取总RNA。  以针对小鼠TNFα基因序列设计的上下游引物(上游引物为5'-GGC GGT GCC TAT GTC TCA G-3',下游引物为5'-GGG CAG CCT TGT CCC TTGA3')进行RT-PCR。PCR扩增产物以2%琼脂糖(含EB 0.5 pg/mL)进行电泳分离,电压50 V,电流10 mA。电泳2 h左右,以Kodak数字成像系统成像拍照。

    1.6  标本制备和染色

    将修剪好的颅骨沿中线剖开,一半10%甲醛固定液固定,用于抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,另一半浸入PBS冷藏,用于甲苯氨蓝染色。TRAP酶染色通过TRAP染色试剂盒进行(中科院血液病研究所,天津),染色结果数码相机拍照,将胞浆红染的多核细胞(核数≥3个)定为破骨细胞[2]  甲苯氨蓝染色后[3],显微镜下观察颅骨溶解后产生的陷窝。取随机视野对吸收陷窝的总面积进行积分,计算7份样品的平均值。

    1.7  统计学处理

    计量资料均采用均值±标准差(±s)表示。采用单因素方差分析(AVONA)对各组资料时行统计学分析。借助SAS 6.0统计软件进行分析,以P≤0.05为显著性差异的指标。

    2  结  果

    2.1  动物一般情况

    各组动物术后送返原笼,麻醉苏醒后常规饲养。各组动物均存活至实验结束,其间精神行为无异常,切口愈合良好,无皮下积液及切口感染等并发症发生。

    2.2  TNFα的表达

    TNF-a的RT-PCR结果如图1所示,小鼠颅骨局部植入CoCrMo合金后,骨膜中TNFα的mRNA转录条带明显变亮(图1b)。在应用ASO后,TNFα的mRNA转录条带随着ASO剂量的增大逐渐减退(图1c、d),在10 μg组,局部骨膜中的mRNA含量接近于假手术组(图1d)。

    采用ELISA方法对骨膜组织中的TNFα蛋白含量进行定量结果如图2所示,阳性对照组(图2b)较之假手术组上升了近1.5倍,应用了ASO之后TNFα逐步下降。其结果与RTPCR结果相平行,统计学结果显示,组2(图2b)、组3(图2c),相对于组1(图2a),均有显著性差异(P≤0.05)。组4(图2d)的结果甚至于低于假手术组(图2a),但统计学检验显示它们之间无显著性差异(P>0.05)。

    2.3  破骨细胞TRAP染色和TRAP定量

    破骨细胞TRAP染色结果显示,植入CoCtMo合金后的小鼠颅骨可见大量的破骨细胞形成。破骨细胞在镜下形体较大,外形不规则,胞浆红染,可见较多的胞外突起,胞核深染,核数超过3个,有时可见核成环形排列于胞膜下,细胞周围偶可见透亮带出现。应用ASO后,破骨细胞的数量随着ASO的用量增大而递减。骨膜组织内的TRAP酶活性定量检测结果如图3所示,阳性对照组(图3b)较之假手术组上升了10倍以上,应用了不同剂量的ASO后,TRAP酶活性随剂量逐步恢复至接近正常。再次给予TNFα蛋白后TRAP酶活性再次上升,组2(图3b)、组3(图3c)以及回复组(图3e),相对于组1(图3a),均有显著性差异(P≤0.05),组4(图3d)相对于组1(图3a)无显著性差异(P>0.05)。

    2.4  骨吸收陷窝的观察和积分

    颅骨经骨片经甲苯胺蓝染色后置于显微镜下观察。在阳性对照组中,可见大量圆形,椭圆形或梭形的骨吸收窝,陷窝深浅不等,着色浓度不一。经ASO治疗后,陷窝的数量和大小均明显减少,使用外源性TNFα进行回复试验后,被抑制的吸收陷窝复又大量出现。对陷窝面积进行积分的结果见图4,吸收面积的积分结果显示:假手术组为(0.049±0.02)mm2,单纯微粒植入阳性对照组为(0.347±0.09)mm2,应用了低剂量ASO治疗(5 μg)后,吸收面积降至(0.123±0.05)mm2,采用高剂量ASO治疗(10 μg)后吸收面积降至(0.052±0.02)mm2,再次给予外源性TNFα后,吸收面积再次明显上升至(0.412±0.07)mm2。统计学分析显示,组2(图4b)、组3(图4c)以及回复组(图4e),相对于组l(图4a),均有显著性差异(P<0.05),组4(图3d)相对于组l(图3a)无显著性差异(P>0.05)。

    图1  小鼠颅骨骨膜中TNFα的mRNA含量的RT-PCR结果  图2  小鼠颅骨骨膜中TNFα蛋白的ELISA定量结果(±s),与假手术组比较,*P<0.05,**P>0.05  图3  小鼠颅骨骨膜中TRAP定量结果(±s),  以假手术组A的活性为100%,余其余结果表示为与其的百分比。与假手术组比较,*P<0.05,**P>0.05。e组为在高剂量ASO治疗7 d后,使用外源性TNFα进行回复试验的结果  图4  小鼠颅骨吸收陷窝面积的积分结果(±s),与假手术组a比较,*P<0.05,**P>0.05

    3  讨  论

    3.1  TNFα与假体松动

    无菌性松动导致的假体失败仍然是临床需要面临的重要课题之一,目前并无非常满意的治疗方法和策略,大部分时候只有进行翻修手术,给病人带来严重的身心创伤和经济负担,特别是高龄病人逐年增多,不仅手术的风险高,而且围手术期的并发症也多[4]。

    引起假体松动的生物学机制目前仍不十分清楚,但许多研究证实,微粒诱导的植入物周围的炎性反应及继发的骨溶解是关节置换后假体无菌性松动的主要原因[5]。在这些因子中,TNFα是一个在破骨细胞生成激活过程中的一个关键因子[6],它不仅可以通过提高对M-CSF的敏感性和刺激c-Fms的表达增加破骨细胞前体细胞的增殖分化,扩大破骨细胞的来源,还可以促进这些前体细胞分化成熟为具有功能的破骨细胞[7]

    3.2  抗TNFα治疗

    针对TNFα的治疗性策略并不多,一方面,是研究者们认识到,TNFα在炎症发生发展过程中的重要作用,是一种需要被严格调控的介质分子,原发或继发性的系统性的TNFα失衡,往往会引发很多疾病;另一方面,现有的抗TNFα药物大部分药物是抗TNFα抗体,也有一部分是抗TNFα的可溶性受体[8],由于种种原因,难以应用于假体松动的防治中去。虽然抗TNFα蛋白已经用于治疗其他的慢性炎性骨关节疾病如类风湿关节炎[9],并获得美国FDA认证[10],但是这些全身使用的抗TNFα蛋白具有可能激活潜伏期的肺结核的潜在危险,其临床研究还发现这些药物有引起充血性心脏衰竭以及重度感染和脓血症等疾病的危险,这些可能的副作用现已都写入了FDA给这些的产品的标注之中[11]。其次,由于大分子的抗体和受体蛋白自身存在的不稳定性,免疫原性,潜在的毒性,疾病传播的隐患,以及高昂的价格,更限制了其以身临床应用,尤其是全身性的,长时间的应用。目前,对于微粒诱导的骨溶解,尚未见应用抗TNFα蛋白取得满意结果的报道,有的学者将其归咎于引入外源性蛋白所造成的免疫反应[12]。

    3.3  抗TNFα的ASO抑制微粒诱导的骨溶解

    ASO是一段人工设计的10~20个碱基的DNA片断,进入细胞以后可以通过碱基之间的配对与目标mRNA结合,一方面可以通过简单的位阻效应影响核糖体翻译复合物与mRNA的结合从而使翻译无法正常进行,另一方面更为重要的是,这种RNA-DNA的杂交双链可以引发RnaseH对杂交双链中的RNA的切割降解作用,使细胞内的目标mRNA迅速减少[13]。随着生物信息学的快速发展,目前只要知道目标基因的mRNA序列,就能够设计出能够有效抑制其表达的ASO[14]。这一方法已经被美国FDA批准用于治疗某些疾病[15]。

    相比于RNA干扰(RNAi)和核酸酶(ribozyme)等其他主要限于基础性研究的反义技术[16],ASO不仅更安全,而且从生产方式上看,可以通过自动化的化学合成来大量获得,接近于传统的药物,相对于需要生物合成的大分子的抗体或者受体蛋白来,价格非常低廉。ASO的同时它还没有蛋白质自身所具有的免疫原性,这一方面不需要人们费尽心思的去寻找降低免疫原性的各种重组修饰手段,也有利于药物的长期使用和反复使用。但是,作为一种小片断的核酸分子,ASO易被体内的酶所降解,目前这一问题通用的对核酸磷酸和核糖骨架的多种修饰可以得到比较好的解决,可以在体内长时间有效的发挥作用[17]。本实验所采用对核酸磷酸的磷硫酰化修饰,就可以明显地延长其半衰期。作者在预实验中摸索给药浓度时,  以及在进行实验的2周内,ASO均可稳定地发挥作用,有效地抑制了微粒诱导的骨溶解。

【参考文献】
  [1] Knocha M,Wedemeyera C,Pingsmanna A,et al.The decrease of particleinduced osteolysis after a single dose of bisphosphonate[J].Biomaterials,2005,26:1803-1808.

[2] Kotake S,Udagawa N,Takahashi N,et al.IL17 in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis is a potent stimulator of osteoclastogenesis[J].J Clin Invest,1999,9:1345-1352.

[3] Sabokbar A,Fujikawa Y,Neale S,et al.Human arthroplasty derived macrophages differentiate into osteoclastic bone resorbing cells[J].Ann Rheum Dis,1997,7:414-420.

[4] 张 超,戴尅戎,汤亭亭,等.红霉素抑制磨损颗粒诱发体内骨溶解的研究[J].中国矫形外科杂志,2007,15:1100-1103.

[5] Rena WP,Markela DC,Zhang R,et al.Association between UHMWPE particleinduced inflammatory osteoclastogenesis and expression of RANKL,VEGF,and Flt1 in vivo[J].Biomaterials,2006,27:5161-5169.

[6] Desai SB,Furst DE.Problems encountered during antitumour necrosis factor therapy[J].Best Pract Res Clen,2006,20:757-790.

[7] Rice R,Rice DPC,Olsen BR,et al.Progression of calvarial bone development requires Foxc1 regulation of Msx2 and Alx4[J].Dev Biol,2003,262:75-87.

[8] Boyce BF,Li P,Yao Z,et al.TNF-α and pathologic bone resorption[J].Keio J Med,2005,54:127-131.

[9] Feldmann M.Development of antiTNF therapy for rheumatoid arthritis[J].Nat Rev Immuno,2002,2:364-371.

[10]Taylor PC.AntiTNFα therapy for rheumatoid arthritis:an update[J].Intern Med,2003,42:15-20.

[11]Palladino MA,Bahjat FR,Theodorakis EA,et al.AntiTNFα therapies:the next generation[J].Nat Rev Drug Disc,2003,2:736-746.

[12]Schwarz EM,Benz EB,Lu AP,et al.Quantitative smallanimal surrogate to evaluate drug efficacy in preventing wear debrisinduced osteolysis[J].J Orthop Res,2000,18:849-855.

[13]Opalinska JB,Gewirtz AM.Nucleicacid therapeutics:basic principles and recent applications[J].Nat Rev Drug Discov,2002,1:503- 514.

[14]Sullenger BA,Gilboa E.Emerging clinical applications of RNA[J].Nature,2002,418:252- 258.

[15]Anderson KP,Fox MC,BrownDriver V,et al.Inhibition of human cytomegalovirus immediateearly gene expression by an antisense oligonucleotide complementary to immediateearly RNA,antimicrob[J].Agents Chemother,1996,40:2004-2011.

[16]Qiu S,Adema CM,Lane T.A computational study of offtarget effects of RNA interference[J].Nucleic Acids Res,2005,33:1834-1847.

[17]AboulFadl T.Antisense oligonucleotides:the state of the art[J].Curr Med Chem,2005,12:2193-2214.


作者单位:1.南京军区南京总医院 第二军医大学南京临床学院骨科;2.南京大学生物医药重点实验室

作者: 2009-8-24
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