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【摘要】 [目的]研究化疗后骨肉瘤组织中残存肿瘤细胞中肿瘤转移相关基因1(metastasis associated 1，MTA1)的表达在骨肉瘤发生、发展中的作用及其生物学意义，探讨化疗后骨肉瘤中MTA1的表达与骨肉瘤患者预后之间的关系。[方法] 采用免疫组织化学SP法，检测31例化疗后骨肉瘤组织中MTA1的表达。并应用统计学方法分析其与预后的关系。[结果]统计学分析显示化疗后MTA1的阳性表达率为54.84%，其表达与患者的性别、年龄、发病部位、发病-就诊时间及肿瘤的体积无相关性。通过对所有病人随访结果的对比分析，发现MTA1阳性表达的预后良好率为35.29%(6/17)，明显低于阴性表达组(78.57%，11/17，P=0.016)。[结论]MTA1表达阳性的患者预后差，它反映了化疗后残存骨肉瘤细胞侵袭、转移的生物学活性;检测MTA1的表达可作为判断骨肉瘤患者预后的参考指标。
【关键词】 骨肉瘤; 新辅助化疗; MTA1; 预后
Relation between prognosis and expression of MTA1 in patients with osteosarcoma after chemotherapy∥BU Guo-qiang,YU Xiu-chun.Orthopedic Department, Heze Municipal Hospital, Heze 274000, China
Abstract: To discuss the clinical and the biological significance of the expression of residual tumor cells MTA1 in the occurrence and progression of osteosarcoma after chemotherapy, and to investigate the correlation between MTA1 expression and the prognosis in osteosarcoma patients. SP immunohistochemical technique was used to detect the expression of MTA1 in the residual tumor cells from 31 osteosarcoma patients after chemotherapy.Among 17 patients with positive MTA1 expression, 6 had good prognosis (35.29%); and among 14 patients with negative MTA1 expression, 11 had good prognosis (78.57%). There were significant differences between groups (P<0.05).The MTA1 expression in osteosarcoma after chemotherapy could reflect the invasive, metastatic biological activities of the residual tumor cells. It is helpful to detect MTA1 expression for the prognosis of patients with osteosarcoma.
Key words：osteosarcoma; neoadjuvant chemotherapy; MTA1; prognosis
肿瘤转移相关基因1(metastasis associated 1，MTA1)是新近发现的一个肿瘤转移相关基因，其表达与许多恶性肿瘤的浸润转移能力呈正相关[1]。为探讨骨肉瘤化疗后MTA1基因的表达与病人预后的关系，本研究采用免疫组织化学方法，检测MTA1蛋白在31例化疗后病人手术切除骨肉瘤组织中的表达，并分析其与预后的关系。
1 材料与方法
1.1 标本选择及切片 所选病例符合以下标准：①在济南军区总医院骨病科经穿刺或切开活检，病理组织学证实为骨肉瘤;②治疗前经胸片、CT扫描排除远处转移，Enneking分期均为ⅡB期的肢体骨肉瘤;③入院前未行任何治疗;④随机应用MMIA和DDP-IFO-ADM两种化疗方案系统治疗，术前行2个疗程化疗，手术切除肿瘤组织;⑤有化疗前后病理标本且免疫组化染色后无脱片。按上述标准选择济南军区总医院骨病科1999年1月～2005年12月诊断为骨肉瘤资料完整的31例患者。所有标本经常规甲醛固定、石蜡包埋。每例组织蜡块4 μm连续切片10张，1张切片HE染色作光镜下诊断复查，另1张切片作MTA1免疫组织化学染色，其余备用。
1.2 临床资料 本组男14例，女17例;平均年龄15.4岁(6～29岁)。病变部位：股骨远端16例，胫骨近端13例，肱骨近端1例，腓骨近端1例。所有诊断均经病理组织学证实。参照Enneking外科分期，均为Ⅱb期。手术方式和例数：保留骨骺的瘤段骨切除灭活再植术5例[2]、瘤段骨切除灭活再植术13例、瘤段骨切除特制肿瘤型人工假体置换术9例、瘤段骨切除同侧锁骨反转代肱骨术1例、肿瘤扩大切除术1例、髋关节离断术1例、瘤段骨切除灭活同时行特制肿瘤型人工假体置换术1例。随机应用MMIA和DDP-IFO-ADM两种化疗方案系统治疗，2疗程后行外科手术。所有患者均获得随访，平均随访24.7个月(5～69个月)。随访期内死亡8例，其中7例为肺转移或复发后肺转移患者，1例死于化疗并发症脑出血。另外肺转移带瘤生存2例，局部复发4例，其中再次行肿瘤扩大切除2例，根治性切除2例，随访5～44个月正常。本研究将随访期发生肺转移、肿瘤复发及其他原因引起死亡的病例均归为预后不良组，其余病人为预后良好组。
1.3 试剂及来源 一抗为浓缩型山羊抗人MTA1多克隆抗体，为Santa Cruz公司产品。即用型SP超敏试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，严格按SP法步骤操作。用PBS液代替一抗作为阴性对照，已知阳性标本作阳性对照。
1.4 免疫组织化学染色 采用SP法，常规脱蜡至水化，以枸橼酸盐缓冲液微波炉抗原修复法修复抗原，一抗工作浓度是1∶500，用PBS液稀释，其他步骤均严格按照说明书操作。
1.5 结果判断 MTA1蛋白主要表达于细胞核及细胞浆[3],其阳性细胞的标志为细胞核出现棕黄色着色。对每例切片随机选择10个高倍视野(10×40)，每个视野下数100个细胞，总计1 000个肿瘤细胞，根据细胞阳性的比例进行判断：阳性细胞比率≥10%为阳性(+)表达，<10%为阴性(-)表达。
1.6 统计学方法 采用SPSS 10.0软件行x2检验。
2 结果
MTA1蛋白主要在细胞核表达，部分细胞胞浆也呈阳性反应，呈棕黄色颗粒状(见图1)。根据前述MTA1阳性的分析判定标准，本组病例中17例为阳性表达，14例为阴性表达，阳性表达率为54.84%。经统计学分析，发现化疗后MTA1的阳性表达与患者的性别、发病部位、发病-就诊时间无相关性(P=0.092;0.058;0.624);骨肉瘤患者的年龄、肿瘤的体积与MTA1的表达同样无相关性(t=-1.269，P=0.214;t=1.132，P=0.270)。图1a化疗后骨肉瘤细胞中MTA1呈阴性表达 ×400
图1b化疗后骨肉瘤细胞中MTA1呈阳性表达 ×400 本组病例中骨肉瘤术后MTA1的阳性表达组中预后良好率为35.29%(6/17)，明显低于阴性表达组的预后良好率，有显著性差异(78.57%，11/14，P=0.016)详见表1。表1 MTA1表达与骨肉瘤患者预后的关系
3 讨论
恶性肿瘤的浸润转移是其导致患者死亡的主要原因，也是临床治疗最棘手的问题，因而参与调控肿瘤浸润转移基因的研究一直是一个热点。MTA1是一个被证实的与肿瘤转移相关的基因，它与许多恶性肿瘤的浸润转移密切相关，如乳腺癌、食道癌、肝癌[1、4、5]等。但它是否与骨肉瘤有同样的关系，目前尚不明确。有研究表明，在体外高转移性骨肉瘤细胞株表达MTA1的水平明显高于低转移性细胞株;低转移性细胞株在转染mta1后其侵袭能力呈显著性增强[6]。
1994年Toh等应用差异cDNA文库筛选(differential cDNA library screening)方法，从13762NF大鼠乳腺癌转移系统筛选克隆出候选转移相关基因mtal，Nawa等[7]在人类高转移性乳腺癌细胞株中发现mtal相关序列MTA1。应用荧光原位杂交方法发现人mta1基因定位于染色体14q32.3[8] ，其编码的蛋白质含715个氨基酸残基，分子量8.14万u，在羧基端696～705处有一富含脯氨酸的支链，与SH3(the src homology3 domains)结合域序列一致。SH3结合域参与信号传导通路中蛋白间相互作用的调控，并参与调控细胞骨架成份蛋白，提示MTA1蛋白可能参与调控信号传导通路及细胞骨架成份蛋白。此外，人MTA1蛋白还含有一锌指DNA结合域Cys-X2-Cys-X17-X2-Cys(在393残基处)、一亮氨酸拉链结构域(在251残基处)和许多SPXX域，这些结构常见于基因调节蛋白和DNA结合蛋白中。在MTA1氨基酸残基末端，有2个高酸性区域，这些负电荷区域是许多转录因子酸性转录激活域的特征。在MTA1蛋白分子中还有一些蛋白与蛋白、蛋白与DNA相互作用的结构域，如BAH结构域(bromo-adjacent homology domain)、SANT结构域(SWI3，ADA2，N-CoR and TFIIIB DNA-binding domain)、GATA样锌指模体[7]。这些结构可能有助于恶性肿瘤的浸润转移。
MTA1促进恶性肿瘤转移的分子机制可能与组蛋白去乙酰化转录调节有关。组蛋白末端乙酰化能中和组蛋白中的阳离子，从而降低DNA与乙酰化区域的结合，打开染色质结构，促进转录;相反，组蛋白去乙酰化使染色质结构变得紧密，抑制转录。研究表明，MTA1作为NuRD的一个亚单位[9]，与组蛋白去乙酰化成正相关。作为组蛋白去乙酰化酶的辅助激动因子抑制转录，成为转录过程中一个辅助抑制因子，实现其对下游基因的调控。另外，在MTA1蛋白结构分析中，已知MTA1蛋白具有磷酸化位点和SH3结合位点，可与细胞内一些蛋白相互作用，参与信号转导从而调控与侵润转移有关的蛋白质的表达，细胞侵袭转移还往往涉及细胞骨架重塑、细胞表面黏附分子的改变、细胞形状的改变。在胰腺癌中，mta1转染的胰腺癌细胞动力和穿过上皮层的侵袭能力增加[10]。观察发现，MTA1可以显著改变胰腺癌细胞角蛋白丝系统的组装及细胞骨架蛋白的定位，并使细胞获得更具侵袭性和转移性的表型。但在其他恶性肿瘤尤其是骨肉瘤细胞中，MTA1是否也能使细胞骨架发生改变而促进细胞侵袭转移，还有待于进一步研究。MTA1可以通过以上这些机制实现其促进肿瘤浸润、转移的目的。因此，MTA1可成为一个能比较准确地预测恶性肿瘤浸润转移的指标。
目前已有很多文献报道mtal/MTA1基因的mRNA表达水平与一些上皮源性恶性肿瘤的转移或浸润潜能有关，如乳腺癌、卵巢癌、食管癌、贲门癌等[3、11]。关于mtal/MTA1基因与骨肉瘤的复发或转移的报道较少，有关其在化疗后骨肉瘤中表达的研究国内外未见报道。李新志等[5]通过应用半定量RT-PCR检测高转移性骨肉瘤细胞株和低转移性骨肉瘤细胞株中MTA1的表达水平，发现高转移性骨肉瘤细胞株中MTA1的表达水平明显高于低转移性骨肉瘤细胞株，有统计学意义，表明mtal/MTA1基因表达水平与骨肉瘤细胞的侵袭、转移潜能相关。为了进一步证明MTA1促进骨肉瘤转移的作用，该研究还通过真核表达质粒转染mtal基因到低转移性骨肉瘤细胞株，使之能稳定表达MTA1，可以检测到低转移性骨肉瘤细胞株在转染后的侵袭能力呈显著性增加。但之前的研究均显示mtal/MTA1基因主要与肿瘤的淋巴结转移有关，而骨肉瘤的转移则以血行转移为主，故二者之间的关系尚需结合临床资料进一步验证。
本研究采用免疫组织化学方法，测定了MTA1蛋白在31例化疗后骨肉瘤组织中的表达。结果表明，MTA1蛋白主要表达于细胞核和细胞浆，与Moon等[5]的报道一致。本研究中化疗后MTA1的阳性表达率为54.84%，其表达与患者的性别、年龄、发病部位、发病-就诊时间及肿瘤的体积均无相关性(P=0.092;0.214;0.058;0.624;0.270)。通过对所有病人随访结果的对比分析，发现阳性表达组中预后良好率为35.29%(6/17)，明显低于阴性表达组(78.57%，11/17，P=0.016)。这说明检测化疗后MTA1是否高表达有助于判断新辅助化疗支持下骨肉瘤患者的预后。骨肉瘤患者的预后一方面与肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度有关，另一方面也与化疗后残存肿瘤细胞侵袭、转移的潜能有关。化疗后骨肉瘤中MTA1的表达能够反映化疗后残存肿瘤细胞的侵袭、转移等分子生物学特性，所以，通过检测化疗后骨肉瘤中MTA1的表达，有助于更准确的判断患者的预后。
综上所述，化疗后骨肉瘤中MTA1的表达能够反映化疗后残存肿瘤细胞的侵袭、转移等分子生物学特性，是影响病人预后的因素。通过检测化疗后骨肉瘤中MTA1的表达有助于评价化疗后残存骨肉瘤细胞的转移潜能，更准确的判断患者的预后，指导骨肉瘤的临床治疗。
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作者单位：1.山东省菏泽市立医院骨科 274000;2.济南军区总医院骨病科，济南 250031