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【摘要】 [目的]通过测定TNF-α及IL-18在正常组与实验组椎间盘组织中的表达，探讨在椎间盘退变中的作用，进一步了解椎间盘退变的发生机制。[方法]收集新疆石河子大学医学院第一附属医院骨科椎间盘突出症患者术后椎间盘病理组织34例用于实验组，年龄27～69岁，平均年龄46.24±11.25岁;取脊柱骨折外伤术后椎间盘组织标本7例，并取石河子大学医学院病理科尸检椎间盘标本8例，共15例用于对照组，年龄25～52岁，平均年龄40.07±8.43岁。采用免疫组化法和ELISA两种方法进行检测。[结果]光镜下观察，免疫组化检测TNF-α、IL-18蛋白表达阳性细胞表现为细胞浆中出现棕黄色、褐色或浅棕黄色染色，结果判定及统计学分析后表明：实验组TNF-α蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，实验组IL-18蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。Elisa法证实实验组中TNF-α含量为82.18±21.91 ng/ml，IL-18的含量为45.39±21.23 ng/ml;对照组中TNF-α含量为8.68±0.78 ng/ml、IL-18含量为3.58±2.84 ng/ml。两者差异均有统计学意义(P<0.01)，且两种细胞因子的表达均与患者年龄及病程呈正相关。[结论]椎间盘组织中细胞因子TNF-α及IL-18表达与椎间盘退变有关，推测可能是导致椎间盘组织退变的重要原因之一。
【关键词】 肿瘤坏死因子-α; 白介素-18; 椎间盘突出症; 免疫组织化学; Elisa法
Detection of tumor necrosis factor-α and interleukin-18 in herniated intervertebral disc and their significance∥SHANG Qi-song，HUANG Bo，SHENG Wen-Hui，et al.Department of Orthopaedic Trauma，Shihezi People’s Hospital，Xinjiang 832000，China
Abstract: To detect the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α )and interleukin-18(IL-18)protein in herniated intervertebral disc，and discuss the role of TNF-α and IL-18 protein in the course of the intervertebral disc degeneration and to clarify the mechanism of the lumbar intervertebral disc degeneration and herniation. Forty nine specimens were studied from December 2005 to April 2007 in the First Affiliated Hospital of Shihezi Medical College.Experimental group contained thirty-four herniated intervertebral disc and control group contained fifteen discs，which were collected from the patients with spine fracture or autopsy. The specimens were divided into two parts，one part was fixed in 10% formalin about 24 hours and was embedded in paraffin.Four μm serial sections and S-P method were used.The sections were stained with TNF-α and IL-18 monoclonal antibodies，and the results were observed by OLYMPUS microscope.Another part was changed into well-distributed liquid，which was determined by Elisa method respectively，in order to detect density of TNF-α and IL-18 protein. Software SPSS 13.0 was used for statistical analysis.1 TNF-α and IL-18 protein were expressed mostly in cytoplasma.The expression of IL-18 in the experiment group was obviously higher than in the control group.There were statistical significances(P<0.01).The expression of TNF-α in the experiment group was obviously higher than in the control group.There was statistical significance(P<0.01).2 The method of Elisa confirmed that TNF-α and IL-18 contents in the experiment group were markedly higher than the control group. There was statistical significance(P<0.01).There is obvious link between the expression of TNF-α and IL-18 proteins in herniated intervertebral disc and disc degeneration. The increase of the expression of TNF-α and IL-18 proteins may be the cause of intervertebral disc herniation and disc degeneration.
Key words：tumor necrosis factor-α; interleukin-18; intervertebral disc herniation; immunohistochemistry; enzyme linked immunosorbent assay
人椎间盘随年龄的增长而发生退变。生理性的椎间盘退变是正常的生物学反应，但它与病理过程并无明显界限。椎间盘退变被认为是临床上椎间盘突出症、椎管狭窄、椎间盘源性疼痛、慢性下腰痛的病理基础。近年来报道由于椎间盘退变引起的腰腿痛患病率高达65%～85%，仅美国一年因此而行手术治疗的病人高达300 000人之多。关于椎间盘退变的机制目前仍不很清楚，许多学者认为与酶、外伤、免疫、缺氧、内分泌、生物力学、基因等因素有关[1]。椎间盘的退变主要表现为细胞外基质的改变。目前认为生物化学机制主要是其中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-18(interleukin-18，IL-18)等发挥重要作用。
1 资料与方法
1.1 病例收集 收集石河子大学医学院第一附属医院骨科2006年3月～2007年4月的41例椎间盘疾病患者的椎间盘组织，所有组织均在手术中由同一主刀医师切取。其中34例腰椎间盘突出症患者术后椎间盘组织为实验组，年龄27～69岁，平均年龄46.24±11.25岁。7例患者脊椎骨折术后椎间盘组织和8例尸检正常椎间盘组织共15例为对照组，年龄25～52岁，平均年龄40.07±8.43岁。按照国际判定标准[2]，将所有组织标本经医学院病理学专家确诊是否有退变及其程度。
1.2 实验方法 每1例标本取出后一部分经福尔马林溶液固定24 h，石蜡包埋制成4 μm切片;另一部分研磨成组织匀浆后，离心提上清液后贴标签存放于-73℃冰箱备用。实验时集中取出进行免疫组化S-P法及ELISA法测定。
1.3 主要试剂 羊抗人IL-18单克隆抗体由美国SANTA CRUZ公司提供，鼠抗人TNF-α单克隆抗体由北京博奥森生物技术有限公司提供。
1.4 结果判定标准
1.4.1 免疫组化S-P法：TNF-α和IL-18的蛋白表达以在细胞胞浆中出现浅棕黄色、棕黄色或褐色染色为阳性。光镜高倍视野中随机计数10个不重复视野，染色结果结合阳性率和着色强度进行半定量分析，由两项积分相加进行评分(见表1)。
表1 TNF-α和IL-18 染色结果评分标准阳性细胞百分比记分着色强度强度记分评定结果积分分级0～25%0无着色00-26～50%1浅棕黄色11-2+51～75%2棕黄色23-4++76～100%3棕褐色35-6+++
1.4.2 ELISA法：首先在波长450 nm的酶标仪上读取各孔各组织匀浆样品的OD值;然后将读取的OD值及标准品浓度值输入ELISA Calc.exe，可得出标准曲线图;最后将样品的OD值依次输入，可得出各组织匀浆样品的浓度值。
1.5 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，其中免疫组化检测TNF-α和IL-18蛋白表达以阳性率表示，采用秩和检验;ELISA法检测TNF-α和IL-18蛋白表达的数据以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验;TNF-α和IL-18表达与年龄、病程的相关性采用Spearman及Pearson相关分析。P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HE观察结果：退变椎间盘组织细胞密度较大多数组织的细胞密度低，细胞分布不均匀，结构不清晰，胶原纤维排列紊乱，退变的髓核组织细胞胞质空泡化，出现肥大的软骨细胞“巨克隆”，呈现出软骨细胞的巢样结构，脊索细胞和软骨细胞分布在髓核与纤维环中，髓核组织内的基质降解明显，正中有空隙出现(见图1～2)。
2.2 免疫组化S-P法检测结果：TNF-α、IL-18的蛋白表达着色于细胞胞浆，呈浅棕黄色、棕黄色或褐色染色颗粒(见图3～4);且TNF-α、IL-18在退变组椎间盘组织中的阳性表达明显高于对照组，两组差异有统计学意义(P<0.01)(见表2)。表2 TNF-α和IL-18在正常与退变椎间盘组织中的表达比较TNF-αIL-18-++++++阳性率(%)-++++++阳性率(%)正常组1140026.67141006.67退变组21291194.125913785.29注：经秩和检验，TNF-α的u值为22.757，P=0.000;细胞因子IL-18的u值为18.929，P=0.0002.3 ELISA法检测结果示： 实验组TNF-α、IL-18含量分别为82.18±21.91 ng/ml、45.39±21.23 ng/ml，均明显高于对照组8.68±0.78 ng/ml、3.58±2.84 ng/ml，差异有统计学意义(见表3)。
2.4 再经相关性分析得知：退变组椎间盘组织中TNF-α的含量与患者年龄呈正相关(r=0.778，P<0.01)，与患者病程呈正相关(r=0.732，P<0.01);组织中IL-18的含量与患者年龄呈正相关(r=0.806，P<0.01)，与患者病程呈正相关(r=0.855，P<0.01)。
3 讨论
椎间盘退变已经被公认为引起脊柱退行性变的主要原因，但引起椎间盘退变的机制仍不清楚。
许多学者指出在椎间盘开始出现退变的同时，位于内层的髓核组织的水分开始逐步丢失，在椎体运动时，内层的髓核组织对外层纤维环的流体压力较正常时的压力大。在长时间且超大压力作用下，纤维环的内层开始退变，产生放射状的裂纹，严重者可以直接破裂到外层的纤维环，且在椎间盘组织退变的同时，软骨终板也同时发生退变，出现部分骨化[3]。有学者认为，椎间盘的退变始于软骨终板的退变，椎间盘的生物化学成分中富含水、胶原、蛋白多糖等，是椎间盘发挥生物功能的物质基础，而软骨终板是供应椎间盘营养的平台，由于椎间盘的营养大部分来自于终板组织，这种骨化的出现直接影响到了椎间盘的营养供给[4]。表3 椎间盘组织匀浆中TNF-α、IL-18浓度比较
炎性细胞因子浓度(ng/ml)TNF-αIL-18实验组3482.18±21.91a45.39±21.23b对照组158.68±0.783.58±2.84注：经t检验，a：t=19.532，P=0.000，b：t=11.256，P=0.000 图1～2退变组织HE染色镜下观察结果(400×) 图3退变组椎间盘组织TNF-α免疫组化染色多数阳性(400×) 图4退变组椎间盘组织IL-18免疫组化染色多数阳性(400×) TNF-α是一种具有多种生物学效应的细胞因子，其前体由223个氨基酸组成，分子量为2.58万u。TNF-α主要是由单核细胞及巨噬细胞分泌，其他类型的细胞，如成纤维细胞、淋巴细胞、平滑肌细胞等在一定条件下也具有产生和释放TNF-α的能力，不仅对肿瘤细胞有细胞毒、细胞溶解、抑制增殖等作用，还影响多种正常细胞的生长分化。另外，TNF-α还是一种重要的炎症介质，可增强中性粒细胞和嗜酸性粒细胞功能，刺激它们产生超氧化物，释放溶酶体酶，对其周围细胞产生毒性作用;还可介导其他细胞因子和炎性因子的表达，增强内皮细胞的趋化特性和表面抗原性;另外，它还是一种致纤维化因子，可刺激成纤维细胞增殖。
Yoshida等[5]对突出椎间盘组织病理学和免疫组化等研究发现，髓核突出3 d后，出现大量以巨噬细胞为主的炎症细胞，且炎症细胞随时间的推移而增多。同时观察到TNF-α在髓核突出第1 d就由椎间盘细胞产生，更多研究结果认为椎间盘突出的同时椎间盘组织细胞就开始产生TNF-α等前炎症因子。这些细胞因子从细胞内转移到细胞外，导致突出的椎间盘内巨噬细胞聚集。由于聚集的巨噬细胞强大的吞噬活性及其释放的白介素的作用，椎间盘物质被逐步吸收。
IL-18有许多生物学活性，刺激T细胞增殖;诱导T细胞和自然杀伤(natural killer，NK)细胞产生IFN-γ;使T细胞分泌IL-2、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor ，GMCSF)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α);诱导T细胞和NK细胞表达Fas配体(FasL)等。IL-18可诱导T细胞和NK细胞产生IFN-γ，且在促进IL-12产生大量的IFN-γ的能力方面，IL-18的作用远远超过了巨噬细胞所产生的其他因子的作用。且IL-18在IL-12、IL-15的协同下可诱导生成IFN-γ、GM-CSF、NO等，并诱导CD14+巨噬细胞合成TNF-α。TNF-α反过来又促进IL-18的合成，从而形成正反馈，加重反应。
本实验中退变的椎间盘组织TNF-α、IL-18蛋白表达阳性率较高，为其参与椎间盘退变提供了良好可靠的证据，进一步分析得知，退变组中TNF-α、IL-18的表达与患者年龄及病程具有相关性。验证了患者年龄及病程在椎间盘退变中起一定作用。
吕浩然等[6]在分子水平证实了动物椎间盘退变模型与人类的相似性，在人类腰椎间盘退变中明显上调的基因，在退变动物模型椎间盘中被发现同样上调。这为作者进一步的应用动物模型来研究TNF-α、IL-18在间盘退变过程中的作用机制奠定了基础。
综上所述，TNF-α、IL-18参与了椎间盘退变的病理过程，但其作用机制还有待进一步研究，在本实验中，部分对照组椎间盘组织有TNF-α、IL-18的表达，也同时提示了TNF-α、IL-18在参与椎间盘退变的病理改变时还有其他生物活性。
【参考文献】
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[2] Masuda K，Aota Y，Muehleman C，et al.A novel rabbit model of mild,reproducible disc degeneration by an anulus needle puncture：correlation between the degree of disc injury and radiological and histological appearances of disc degeneration[J].Spine，2005，30：5-14.
[3] 李宝俊，关晓明，丁文元，等.椎间盘退变的基础研究进展[J].中国矫形外科杂志，2007，15：364-366.
[4] 彭宝淦，贾连顺，施杞，等.软骨终板在椎间盘退变过程中的作用机理[J].中国矫形外科杂志，2000，7：147-150.
[5] Yoshida M，Nakamura T，Sei A，et al. Intervertebral disc tissue engineering：characterization of the nucleus pulposus[J].Spine，2006，30：55-61.
[6] 吕浩然，刘尚礼.动物模型椎间盘退变全程基因变化的对比[J].中国矫形外科杂志，2005，13：846-849.
作者单位：新疆石河子市人民医院骨二科，新疆 832000