软骨脱细胞基质复合脂肪源性干细胞构建软骨组织的实验研究

【摘要】  [目的]探讨软骨脱细胞基质支架材料的制备,及其体外复合脂肪源性干细胞构建软骨组织的技术方法。[方法]成年新西兰大白兔脂肪源性干细胞获得，培养，扩增。成年新西兰大白兔新鲜软骨，低温冻干12 h，后经曲拉通、DNA、RNA酶等处理制备成为软骨脱细胞基质支架材料，终浓度为2×107/L的脂肪干细胞种植于软骨脱细胞基质中于软骨细胞方向诱导培养基中培养2周，构建软骨组织。新鲜制备的软骨脱细胞基质及构建的软骨组织分别行组织学、免疫组织化学及透射电镜检测。[结果]实验制备的软骨脱细胞基质支架材料内无细胞结构存在，仅残留空白软骨陷窝。具有合适的孔隙率和孔径大小;复合脂肪源性干细胞后细胞向材料内部迁移，粘附，生长良好。部分载体内细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。[结论]软骨脱细胞基质可作为支架材料应用于软骨组织工程，复合脂肪源性干细胞培养可成功构建软骨组织。

【关键词】  软骨组织; 脱细胞基质; 脂肪源性干细胞

Study on constructing cartilage tissue with adiposederived stem cellsseeded acellular cartilaginous matrix∥WANG Zhaojie，AN Rongze,YU Lizhi,et al.The Orthopedic Department of the Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zhuhai, Guangdong 519100,China

　　Abstract：To investigate the methods of preparing acellular cartilaginous matrix(ACM) and constructing the tissue engineered cartilage with adiposederived stem cells (ADSCs)seeded acellular cartilaginous matrix in vitro.The ADSCs were isolated from adult New Zealand albino rabbits by collagenase,cultured and amplified in vitro.Fresh cartilage isolated from adult New Zealand albino rabbits were freezedried for twelve hours and then treated with Triton X100,Dnase and RNase so as to obtain the ACM.After sterilized with ultraviolet,the ADSCs were seeded in the acellular cartilaginous matrix at a final density of 2×107/L and cultured in chondrogenic differentiation medium for two weeks in order to construct tissue engineered cartilage.Histology,immunohistochemistry and transmission electron microscope (TEM) were applied to examine the fresh ACM and tissue engineered cartilage.The test of hematoxylineosin (HE) staining and TEM showed no cellular structure in the ACM with only recesses left by removed cells.The ACM had suitable interval porosity and aperture size.After integrated with ADSCs,cells migrated into the ACM and adhered to the surface of material and grew well.After cultured in chondrogenic differentiation medium for two weeks,immunohistochemical staining of type Ⅱ collagen showed part of the cells in the material had enhanced expression of type Ⅱ collagen.ACM can be used as scaffold material in cartilage tissue engineering. If it was seeded with ADSCs and cultured in chondrogenic differentiation medium,ACM can be used to construct cartilage tissue successfully.

　　Key words：cartilage tissue; acellular matrix; adiposedrived stem cells

　　关节软骨因损伤或退行性病变引起缺损后，自身修复能力十分有限。近年来，软骨组织工程的迅速发展，为解决这个难题提供了新的途径[1～3]。而寻找一种合适的软骨细胞载体则是当前软骨组织工程研究的焦点之一。脱细胞基质是近几年发展起来的天然支架材料，因其去除了组织中的抗原性成分，故具有良好生物相容性，在组织工程中应用广泛[4]。

　　2001年Zuk PA等[5]从人和大鼠的脂肪组织中发现了具有自我更新能力，活力持久及多向分化潜能的细胞并命名为脂肪源性干细胞。2003年Gimble J、Guilak F[6]又在不同诱导方案下诱导脂肪源性干细胞向脂肪细胞、成骨细胞、肌肉细胞、心肌细胞、神经细胞、软骨细胞等分化进一步证实其干细胞的特性。本实验采用软骨脱细胞基质复合脂肪干细胞的方法体外构建组织工程软骨，探讨软骨脱细胞基质作为软骨组织工程支架材料的可能性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 成年新西兰大白兔，体重约为2.5～4 kg，广东省医学实验动物中心提供，SPF级。

　　1.1.2 主要试剂 胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所);Ⅰ-型胶原酶(Gibco);免疫组化SP试剂盒(天津海洋生物);TritonX100(北京拜尔迪生物工程有限公司);Typsin(华美生物工程有限公司);EDTA(Invitrogen 美国);TGFβ1(Sigma美国)。

　　1.1.3 主要仪器 相差倒置显微镜(德国Leica);调温震荡培养箱(金坛富华);透射电镜(日本 Hitachi);荧光显微镜系统(德国Leica);液氮生物容器(中国四川金凤)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 ADSCs体外分离与原代培养 成年新西兰大白兔颈背部取皮下脂肪组织3 g左右， 0.1 mol PBS广泛清洗3次，眼科弯剪将洗净的组织剪碎至糊状，移入15 ml离心管中，加入2倍于组织体积的0.1%Ⅰ-型胶原酶，在37℃水浴摇床中轻柔搅拌消化15～30 min，液体混浊后，加入等体积含有10%FBS的DMEM终止消化，900 g离心10 min;去掉上清和消化未完全的脂肪组织，沉淀物用5 ml含有10%FBS的DMEM重悬后以80目尼龙筛网过滤，倒置显微镜下观察并进行细胞计数后，种植在一个25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱内培养。

　　1.2.2 ADSCs纯化和传代培养及鉴定 ADSCs原代细胞37℃、5%CO2孵箱内培养24 h后，脂肪干细胞大部分均已贴壁，倒掉培养瓶内液体，用0.1 mol/L PBS轻轻吹打清洗2次，去掉不贴壁的红细胞、成熟的脂肪细胞及细胞杂质，加入5 ml基础培养基;后每2～3 d更换培养基1次;细胞已铺满瓶底达80%以上后，倒掉培养瓶内液体，0.1 mol/L PBS清洗2次后，以0.25%Typsin/0.02%EDTA消化至镜下大部分细胞变圆并有少量细胞悬浮后，倒掉消化液，加入10%FBS的DMEM 5 ml终止消化，用吸管吹打将细胞悬浮，细胞混匀后，以1∶2、1∶3比例分装在2、3个25 cm2培养瓶中;以后传代均按此方法进行。流式细胞仪鉴定CD44、CD45和CD49 d干细胞特性表达。

　　1.2.3 软骨脱细胞基质的制备 手术获取成年兔新鲜耳软骨制备成3 mm×4 mm×1.5 mm体积大小。首先于液氮罐中冻干12 h。随后按以下4步处理: (1)软骨组织块在含苯甲基磺酰氟(0.35 ml/L)的低渗TrisHcl 缓冲液(pH=7.4)中4℃下持续震荡24 h;(2)上述溶液中加入10 g/L的Triton X100继续震荡48 h;(3)软骨块三蒸水充分漂洗后DNA 酶，RNA酶消化过夜;(4)于含10 g/L的Triton X100的TrisHcl缓冲液中处理24 h。最后以三蒸水漂洗48 h。冻干后紫外线照射灭菌。-20℃储存备用。用前DMEM液浸泡2 h。

　　1.2.4 细胞与支架材料复合培养 收集培养第3～4代细胞，调整浓度为2×107/mL左右，制成细胞悬液。六孔培养板内放入材料DMEM液浸泡2 h后吸干液体，向材料表面加0.2 ml细胞悬液，37℃ 5%CO2 饱和湿度静置2 h，取出后翻转，另一面加0.2 ml细胞悬液，同样静置2 h。加入DMEM+10%FBS培养液盖过材料，孵箱内静置培养2 d。2 d后吸尽孔内液体，改换软骨细胞方向诱导培养基进行培养。并行分组。A组：阴性对照组(高糖DMEM+ 1%胎牛血清+100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素);B组：诱导转化组B(阴性对照组+10 ng/ml TGFβ1+6.25 μg/ml胰岛素+50 nmol/L VitC);C组：诱导转化组C(阴性对照组+10 ng/mlTGF-β1+6.25 μg/ml胰岛素+10 mg/L转铁蛋白+10-7mol/L地塞米松+50nmol/L VitC);D组：空白对照组(载体材料未复合脂肪干细胞，直接于阴性对照组培养基内培养)。每24 h行半量换液方法换液。诱导转化培养时间2周构建组织工程软骨。

　　2 结 果

　　2.1 组织学HE染色观察

　　实验制备的软骨脱细胞基质内基本无细胞结构存在，仅大量软骨陷窝，镜下观察见空白区域。软骨脱细胞基质复合脂肪干细胞于软骨细胞诱导培养基中诱导培养2周后，HE染色结果示：阴性对照A组，诱导转化B、C组，材料表面附着多层细胞，材料内部大部分陷窝内有细胞结构存在(图1)，组间无明显差别。

　　2.2 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察

　　软骨脱细胞基质复合脂肪干细胞于软骨细胞诱导培养基中诱导培养2周后，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察见：阴性对照A组，诱导转化B、C组，材料内部大部分陷窝内有细胞结构存在，但Ⅱ型胶原免疫组化检查见阴性对照A组材料内部细胞染色阴性(图2);诱导转化B、C组材料内部部分细胞及陷窝周围呈阳性，尤以接近材料表面细胞染色明显(图3)。但与新鲜软骨Ⅱ型胶原免疫组化染色比较尚有一定差别。

　　2.3 透射电子显微镜观察

　　透射电镜观察新鲜软骨组织可见软骨细胞充分填满于软骨陷窝内，与周围细胞外基质连接紧密。新鲜制备软骨脱细胞基质软骨陷窝内软骨细胞结构成分消失，无或少量残留均匀颗粒状物质。阴性对照A组，诱导转化B、C组材料内部大部分陷窝内有细胞结构存在，且有大量均匀颗粒状细胞分泌基质成分存在，且诱导转化B、C组此物质明显高于阴性对照组(图4)。空白对照D组观察结果与新鲜制备软骨脱细胞基质相似，软骨陷窝内无细胞结构存在。

　　图1 诱导转化B组培养2周后HE染色：材料表面及内部陷窝内有细胞结构存在(×100) 图2 阴性对照A组培养2周后Ⅱ型胶原免疫组化染色：材料内部细胞染色阴性(×100) 图3 诱导转化C组培养2周后Ⅱ型胶原免疫组化染色：材料内部细胞及陷窝周围染色阳性(×100) 图4 诱导转化B组透射电镜观察：陷窝内有细胞结构存在，且有大量均匀颗粒状细胞分泌基质成分存在

　　3 讨 论

　　3.1 本实验制备软骨脱细胞基质时在蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)作用下采用化学除垢剂曲拉通(TritonX 100)裂解细胞及核糖核酸酶(ribonuclease Rnase)、脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease Dnase)消化法获得。在曲拉通破坏细胞膜裂解软骨细胞同时蛋白酶抑制剂保护细胞外基质免受细胞内释放酶的破坏,从而最大程度的保留原细胞外组成成分-Ⅱ型胶原和葡萄糖胺聚糖及其结构;Rnase、Dnase有效去除细胞内释放RNA、DNA后，最大程度的降低材料的抗原型为组织工程细胞复合材料及体内实验提供基础。

　　3.2 现在大部分研究学者多采用干细胞转化后种植于载体材料之上构建组织工程软骨。实验早期作者已使用以上方法，但发现存在转化后细胞形成软骨结节，不易进行分离，且分离后细胞活性下降，很快因为未转化脂肪干细胞的优势生长抑制作用而出现转化后软骨细胞的增殖能力下降，乃至凋亡，加之种植于载体后细胞外环境的剧烈改变，过程的繁琐增加了污染的几率等诸多原因，效果很不理想。在作者将脂肪干细胞复合于软骨脱细胞基质后，再行软骨方向诱导分化，通过细胞因子及材料组成成分Ⅱ型胶原和GAG的协同诱导作用，使脂肪干细胞成功向软骨细胞方向分化，使细胞有较高的Ⅱ型胶原表达、分泌，取得了较理想的结果。

　　3.3 在实验结果鉴定方面选用透射电镜进行结果观察，在以HE染色及免疫组化充分说明细胞向材料内部迁徙、黏附、增殖，并向软骨细胞转化后，采用透射电镜对实验制备的组织工程软骨进行扫描，从微观上观察细胞在材料陷窝内部分布特点及基质分泌情况，这更加充分的、全面的阐述、分析了实验结果。

　　3.4 作者在实验中亦发现了一些问题：虽然结果显示诱导分化方法诱导转化后细胞有较高的Ⅱ型胶原酶水平，但较成体成熟软骨细胞比较还有一定差距，说明目前诱导方案尚不够完善。如能在三维立体条件下、低氧等环境下Ⅱ型胶原酶表达水平将会更高[7]。且构建组织工程软骨时出现分化水平较高这只限于接近材料表面部分，材料内部细胞分化效果差，这可能是静态培养条件下，材料内部细胞营养物质交换较差所致。

　　随着三维培养技术的不断完善，对各种细胞因子和生长因子之间的相互作用的更深入了解和转化诱导条件的逐渐成熟，加之材料学在材料改性、重建方面的高速发展，相信脂肪干细胞和软骨脱细胞基质这两个组织工程的新生力量必定会茁壮成长。

【参考文献】
  　　[1] Karlsson C,Brantsing C,Svensson T.Differentiation of human mesenchymal stem cells and articular chondrocytes: analysis of chondrogenic potential and expression pattern of differentiationrelated transcription factors[J].J Orthop Res,2007,2:152-163.

　　[2] Redman SN,Oldfield SF,Archer CW.Current strategies for articular cartilage repair[J].European Cells and Materials,2005,9:1473-1482.

　　[3] 李 磊，张海宁，孔庆迎，等.脂肪源干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损研究[J].中国矫形外科杂志，2008,15:1173-1176.

　　[4] Badylak S,Obermiller J.Extracellular matrix for myocardial repair[J].Heart Surg Forum,2003,2: 20-26.

　　[5] Zuk PA，Zhu M，Ashjian P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell,2002,12:4279-4295.

　　[6] Gimble J,Guilak F.Adiposederived adult stem cells: solation,characterization and differentiation potential[J].Cytotherapy,2003,5:362-371.

　　[7] 康红军，卢世璧，许文静，等.人脂肪干细胞结合微载体在生物反应器中向软骨细胞分化[J].中国矫形外科杂志，2007,10:773-775.

作者单位：遵义医学院第五附属(珠海)医院骨科，广东 珠海 519100