彩骨髓干细胞体外组织工程软骨形成的实验研究

【摘要】  [目的]探讨骨髓干细胞(BMSCs)在体外不同载体中软骨形成的能力和可行性。[方法]分离培养猪BMSCs，将第3代BMSCs以载体内多点注射和表面点滴法植于A组：Ⅱ型纤维胶原蛋白海绵(fibrin collagen sponge)，B组：生物蛋白海绵(fibrin collagen sponge and bFGF);C组：明胶海绵(gelatin sponge)3种载体上，于4周取材进行组织学分析。[结果]纤维胶原蛋白海绵和生物蛋白海绵组均有软骨细胞形成，明胶海绵无细胞生长。利用SPSS 10.0软件统计学处理，显示B组软骨细胞阳性数量(92.75±10.57)多于A组(36.45±8.34)，有统计学差异(P<0.01)，两组都明显多于C组(0)，有统计学差异(P<0.01)。[结论]MSCs经分离扩增后种植于三维立体结构的纤维蛋白海绵载体上，在含有TGFβ1培养液中形成软骨;在TGFβ1和FGF的双重因子培养中，其软骨的形成能力明显增加。

【关键词】  骨髓基质细胞; 载体; 软骨形成; 组织工程

Tissue engineering cbondrogenesis :an experiment study of bone mesenchymal stem cells∥SONG Shifeng,XIAO Haitao,WU Wei,et al.Department of Orthopaedics,Hainan Provincial People′s HosipitaI,Haikou 325027,China

　　Abstract：To investigate the chondrogenic ability and feasibility of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) in three kinds of cellular carrier.BMSCs were separated and cultured into the third generation,which were cultivated in three knids of carriers by multipoint injection into and dropping on the surface of carriers(fibrin collagen sponge, group A; fibrin collagen sponge and FGF,group B and gelatin sponge, group C ).All samples were analyzed after four weeks.There were a few chondrogenic cells in group A,much more chondrogenic cells in group B,and no cells in group C. According to analysis with SPSS 10.0 software,There were more cartilage cells (92.75±10.57) in group B than in group A(36.45±8.34).It was statistical different (P<0.01).BMSc can be formed to chondrogenesis after augmented and cultivated in the threedimensional fibrin collagen sponge with the medium of contained transforming growth factorβ1.Its ability of chondrogenesis is increased evidently in cultured by diplex growth factors(TGF and FGF).

　　Key words：bone mesenchymal stem cells; cellular carrier; chondrogenesis; tissue engineering

　　骨髓干系胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)也称骨髓的间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，BMSCs的提取分离及传代培养技术已逐渐成熟。如何将BMSCs种植于载体上进行体外人工培养形成软骨样组织还是在探讨中的问题。本研究旨在探讨BMSCs能否在体外几种载体中提供软骨诱导微环境，促进BMSCs向软骨分化并形成组织工程软骨。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养

　　BMSCs培养：抽取8周龄幼猪髂骨骨髓5 ml，用密度梯度离心法分离出有核细胞，再以PBS缓冲液(Gibco公司，美国)和无血清DMEM(Gibco公司，美国)各离心洗涤1次。制备含有0.05 u/ml青霉素、0.05 μg/ml链霉素(Gibco公司，美国)、TGFβ1(Sigma公司，美国)的浓度为5 ng/ml、10%胎牛血清(Hyclone公司，美国)的DMEM培养液。计数有核细胞，以6×105个/cm2的密度接种于培养皿(Gibco公司，美国)，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，贴壁法分离BMSCs 接种3 d后首次换液。待细胞生长达到80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，以1.5×104个/cm2的密度接种，常规传代扩增，第3代细胞用于实验。

　　1.2 载体制作、细胞种植及分析方法

　　将无菌胶原蛋白海绵(fibrin collagen sponge，Sigma公司，美国)、生物蛋白海绵(fibrin collagen sponge +b-FGF，辽宁绿谷制药)、明胶海绵(gelatin sponge南京金陵制药)在无菌条件下裁剪成5 mm×5 mm×5 mm方块状。A组：胶原蛋白海绵;B组：生物蛋白海绵;C组：明胶海绵。三组分别取16个标本，将第3代细胞按5×107个/cm2的密度分别以载体内多点注射和表面点滴法接种到材料上，每块材料接种细胞悬液300 μl。在37℃、5%CO2、100%饱和湿度下加含TGFβ1(5 ng/ml，)的DMEM培养液，每隔2 d换液1次，观察细胞增殖、细胞在支架材料上的黏附及细胞外基质的分泌情况。培养4周取材进行组织学分析。利用细胞直接技术法测定不同载体细胞生长情况，即取免疫组化染色的组织切片，选取三种不同载体构建的组织染色切片4张，每张切片随机选取20个高倍视野进行直接阳性细胞计数，然后组间比较[mean±S.D.(n=4)]应用SPSS 10.0软件进行统计学分。

　　2 结 果

　　2.1 细胞生长情况

　　原代细胞呈集落样生长，培养5～7 d后可见均匀的集落形成纺缍形或长梭形，类似成纤维细胞，但体积较小，核仁1～2个，类似于既往文献报道的BMSCs形态。传代后细胞体积有所增大，有角状突起，增殖迅速，细胞接近融合后呈“旋涡”样生长。接种到材料上后，细胞与胶原蛋白纤维紧密黏附，分泌细胞外基质包埋纤维，基质逐渐增多填满纤维间的空隙(图1、2)。

　　2.2 大体观察

　　B组标本体外培养2周后体积收缩，直径约为3 mm，至4周直径为2 mm;而其他各组均维持直径在3～4 mm的范围内。培养4周后，A、B组表面均光滑，细腻有光泽，形状近似圆球形;C组表面粗糟，呈碎片状;B组标本呈灰白色，同时有很好的硬度和弹性，而A组标本呈灰黄颜色，色较暗，弹性和硬度不及B组。

　　2.3 组织学、电镜观察

　　2.3.1 光镜检查 标本制备 标本经10%的福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察，并采用免疫组化SP法进行标记，所用Ⅱ型胶原试剂盒来自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　光镜结果：A组标本显示：淡紫蓝色软骨基质中见有稀疏的软骨细胞组;可见软骨陷窝样结构，陷窝周围可见蓝染的细胞外基质成分;B组：淡紫蓝色软骨基质中见有软骨细胞，多为单个散在，局灶几个细胞簇聚，细胞数量明显多于A组，而且组织紧密，基质蓝染程度偏高。A组的组织学与B组类似，其陷窝和细胞间的基质沉积较B组少。C组：见散片状较细的胶原基质，未见细胞生长。利用SPSS 10.0软件统计学处理，显示B组软骨细胞阳性数量(92.75±10.57)多于A组(36.45±8.34)，有统计学差异(P<0.01)。两组都明显多于C组(0)，有统计学差异(P<0.01)(图3～6)。

　　2.3.2 电镜检查 透射电镜样品制备：取培养组织1 mm×1 mm×1 mm大小，经2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，丙酮系列脱水，环氧树脂Epon 812包埋，Leiac超薄切片机半薄切片定位后，再行超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅双重染色，JEM-1010型透射电镜观察，摄片。

　　图1、2 第1代细胞呈集落形成纺缍形或长梭形，类似成纤维细胞;2代后细胞体积有所增大，有角状突起，增殖迅速，细胞接近融合后呈“旋涡”样生长 图3、4 (A组)低倍镜显示淡紫蓝色软骨基质中见稀疏散在的软骨细胞，高倍镜见圆形透亮的软骨细胞 (HE×100) (HE×400) 图5、6 (B组)显示淡紫蓝色软骨基质中见成簇的的软骨细胞，软骨基质丰富(HE×100);高倍镜显示细胞呈圆形或椭圆形，核深染(HEX400) 电镜结果：B组：软骨基质中见大量的胶原纤维，排列不规则。软骨陷窝内软骨细胞单个、4个、4个或多个存在，呈不规则形，表面有许多微小突起。细胞周边部可见基质颗粒。细胞质较丰富，胞质内可见粗面内质网、高尔基复合体明显扩张，线粒体多见，少量脂滴。细胞核呈圆形或椭圆形(图7)。 A组：软骨基质同一组，无明显改变，软骨细胞多呈单个存在，少数为两个，细胞极不规则，突起增大，突起表面有较大空白裂隙，细胞器没有B组发达，粗面内质网、高尔基复合体没有明显扩张，细胞核异染色质增多(图8)。

　　2.3.3 免疫组化 标本经10%的福尔马林固定，石蜡包埋切片,HE染色，光镜观察，并采用免疫组化SP法进行标记，所用Ⅱ型胶原试剂盒来自北京中杉金桥生物技术有限公司。A组：(图9) 淡紫蓝色软骨基质中见有软骨细胞，多为单个散在，局灶几个细胞簇聚 (HE×400)，软骨细胞较模糊，可见单个肥大，胞膜不清，软骨基质Ⅱ型胶原 (+);B组：(图10) 淡紫蓝色软骨基质中见稀疏的软骨细胞 (HE×400)，软骨细胞清晰，软骨基质Ⅱ型胶原 (++)。

　　图7 (A组-5000倍)软骨基质中见较多的胶原纤维，软骨细胞多呈单个存在，少数为两个，细胞极不规则，突起增大，突起表面有较大空白裂隙，细胞器没有B组发达，粗面内质网、高尔基复合体没有明显扩张，细胞核异染色质增多 图8 (B组-5000倍)软骨基质中见大量较细的胶原纤维，有64 nm周期横纹，直径在17～50 nm之间，排列不规则。软骨陷窝内软骨细胞1～2个，呈不规则形，表面有许多微小突起。细胞周边部可见基质颗粒。细胞质较丰富，胞质内粗面内质网、高尔基复合体明显扩张，线粒体多见。细胞核呈圆形或椭圆形(图1～2)。图9 (A组) 淡紫蓝色软骨基质中见稀疏的软骨细胞 (HE×400)，软骨细胞较模糊，软骨基质Ⅱ型胶原 (+)。 图10 (B组) 淡紫蓝色软骨基质中见有多个软骨细胞，多为单个散在，局灶几个细胞簇聚 (HE×400)，软骨细胞较清晰，可见单个肥大，胞膜不清，软骨基质Ⅱ型胶原 (++)

　　3 讨 论

　　3.1 骨髓的间充质干细胞分离培养与分化

　　骨髓的间充质干细胞(mesenchymal stem cells)又称骨髓基质细胞(marrow stromal cells，MSCs)属于成体干细胞。因培养液、机械因素、生长因子等的不同，MSCs可分化为骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞等。BMSCs定向分化为软骨细胞的诱导因子是BMSCs定向分化软骨细胞的必要条件[1]。作者在分化MSCs时，一部分采取抽骨髓去除血细胞后加入细胞液培养，通过换液法去除其他细胞，再以贴壁生长的细胞而收取MSCs。此法虽然古老，但操作简便，可以用较多的骨髓血获得足够的MSCs。为了获取MSCs的高纯度，本组应用了密度梯度离心法分离出有核细胞，经贴壁培养获得MSCs。应用已成熟和公认的成软骨培养液，即DMEM液，在TGF-β1诱导下，培养两周分离转换至3代，传代培养见细胞有角状突起，增殖迅速，细胞接近融合后呈“旋涡”样生长，此时的细胞形态更接近于软骨细胞形态。本组的实验证明，3代转换培养BMSCs移植于细胞载体，具有良好的分化软骨细胞能力。

　　3.2 软骨形成与细胞诱导剂的组合作用

　　TGF-β1作为诱导剂，它是一种生物活性极为广泛且具有相对特异性的诱导因子。其可以促进软骨基质合成，能够促进软骨细胞增殖和合成Ⅱ型胶原及蛋白多糖，还能使蛋白多糖硫酸化程度更高，更加符合软骨的生理特点;也能够诱导多种间充质来源的干细胞向软骨细胞分化，维持β软骨细胞的表型稳定。本实验各组从细胞分离培养到载体移植均在TGF-β1诱导因子下进行。A、B组结果显示有软骨细胞形成。Worster将不同浓度的TGFβ1(0～10 ng/ml)与MSCs作单层培养后，细胞的层数和密度都增加，Ⅰ、Ⅱ型胶原的mRNA含量在TGF-β1浓度为5 ng/ml时含量最高，说明TGF-β1能促进MSCs成软骨分化，并有量效关系，最适浓度为5 ng/ml[2]。本实验的TGF-β1浓度为5 ng/ml与以上相同。

　　Tsutsumi等的研究显示，培养液中加入FGF培养很多代，MSCs仍保持多分化的潜能。在10%FBS的单层培养中，FGF大大增加了兔和人MSCs的生长率和生存时间。在体外扩增MSCs时，加入FGF(PGF+MSCs)与未加FGF组相比较，扩增后在成软骨培养液中行微球培养，其结果显示：FGF+组在微球的表面出现球形软骨细胞，并被软骨特征性的蛋白多糖围绕。说明了MSCs在体外扩增时加入FGF，维持了MSCs的成软骨分化能力[3]。Mastrogiacomo等在分析各种生长因子促MSCs成软骨分化的研究显示，FGF是促进MSCs增殖最有效的生长因子[4]，可增加干细胞的软骨分化增殖和软骨基质的形成，在维持软骨形态和防止软骨细胞衰老退变方面起着重要的作用，实验证明了FGF单独或与其他生长因子联合应用均可提高人MSCs的成软骨能力[5～7]。本实验生物蛋白海绵B组，其胶原蛋白吸附有b-FGF成分，并在细胞培养液中具有TGF-β1因子的双重作用下，其形成软骨的能力比A组明显提高，组织切片中软骨细胞显示较多。电镜显示：软骨陷窝内可见多个软骨细胞，细胞质较丰富，胞质内可见粗面内质网、高尔基复合体明显扩张，线粒体多见，结果说明：FGF可激发MSCs的成软骨分化能力。FGF与TGF-β1组合应用对MSCs的成软骨分化能力明显增强。

　　3.3 纤维胶原蛋白海绵的细胞载体作用

　　细胞在三维立体结构的载体中，才具有组织形成的能力。纤维蛋白凝胶作为细胞载体的组织工程形成，已有较到多的文献报道，并证明了其是一种良好的细胞载体[8,9]。尽管将蛋白凝胶用注射法包埋或汇合细胞培养，但其凝胶性易降解，不及细胞的生长速度，而将蛋白胶调和至理想的浓度，才能促成细胞的生长和组织形成，但有一定的技术难度[10]。在细胞培养中，凝胶的阻隔作用，能否使细胞液很好的渗透和足够的营养细胞，有待于质疑，而且，纤维凝胶的支架力学作用不强，故不利于细胞的生长和生存[11]。Mukaida等[12]用Ⅱ型胶原海绵培养兔肋软骨细胞可以很好地维持软骨细胞的表型，得出原代软骨细胞在胶原海绵上培养时更适合临床和实验室的应用的结论。本实验应用纤维胶原蛋白海绵作为细胞载体，可提供细胞培养的三维立体结构，相当于细胞的临时基质，有利于软骨细胞向软骨的有形方向发展。纤维胶原蛋白海绵，具有良好的孔隙和吸附性，便于细胞附着和细胞基质的黏附，是良好的细胞载体。本实验将MSCs细胞悬液多点注入纤维胶原蛋白海绵载体中，使细胞分散均匀，加上海绵的多孔性和吸附性，细胞的附着和营养液均匀渗透，利于细胞良好的生长和基质的合成。明胶海绵孔隙较大，不利于细胞黏附，其降解速度较快，为了克服其不足，有作者将明胶海绵透明质酸结合，增加了支架的机械强度和细胞的黏附性，体外培养软骨细胞生长良好并分泌了大量的Ⅱ型胶原基质[13]。本实验证明：明胶海绵的吸附力虽较强，但易崩解，在培养1周后出现散片状，对细胞的生长不利。

　　本实验证明：纤维蛋白胶原海绵作为MSCs载体在TGF-β1和bFGF的双重作用下，其成软骨的能力明显增加。TGF-β1在软骨细胞中的主要作用是合成代谢，刺激蛋白多糖和DNA合成，也有对软骨细胞分化的双向调节作用，而FGF对软骨细胞分化有协同作用，从而促进软骨细胞增殖[14]。Lazarus等人测量小鼠胫骨近端软骨骺板的不同区域的FGF各型的表达，发现FGF在不同的区域各型的表达不同，FGF可作用于靶器官，调节mRNAs而影响软骨板的发育;在胚胎早期，FGFRs 2 and 4表达较多，表示软骨化的成分较高[15]。本实验利用TGF-β1和FGF的双重作用于软骨形成，将MSCs种植于胶原蛋白海绵并在以上双重因子的培养形成了软骨。鉴于胶原蛋白海绵已大量的应用于临床，可直接作为MSCs载体用于临床软骨损伤的修复。

　　4 结 论

　　MSCs在体外可分离后在TGF-β1培养液中可扩增，种植于三维立体结构的纤维胶原蛋白海绵载体上，在含有TGF2β1培养液中形成软骨。MSCs种植于纤维胶原蛋白海绵载体后，在TGF-β1和FGF的双重培养中，其软骨的形成能力明显增加。如将体外形成软骨植入体内可修复关节软骨，可使MSCs在软骨组织的修复中具有临床应用价值。

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作者单位：海南省人民医院创伤骨科， 海口市 570311