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【摘要】 [目的]本研究通过改进既往标本制作方法，探讨应用不同浓度聚甲基丙烯酸甲酯对骨组织包埋效果的影响，寻找不脱钙骨组织标本包埋制作的理想方法。[方法]骨组织标本取材后，用10%中性福尔马林固定24 h，梯度酒精脱水、二甲苯透明，转入含有15 g/L过氧化苯甲酰的甲基丙烯酸甲酯(UMMA)中，每24h换液1次。从转入UMMA渗透液开始，每天抽滤30 min，以排除组织中的气体。 MMA聚合过程分为3个实验组，分别以30 g/L、35 g/L、40 g/L三种筛选浓度加入过氧化苯甲酰，密切观察样本聚合情况。[结果]3种浓度及凝结时间观察比较，加速剂浓度为35 g/L的标本，在室温25℃左右，约7 d时间开始凝结，并逐渐变硬，组织与包埋剂的硬度均匀，效果理想，制作的切片直接在荧光显微镜下观察，可见两种清晰的矿化标记;加速剂浓度为40 g/L的标本，约3～4 d开始凝结，但出现大量气泡影响观察及制片，效果欠佳;加速剂浓度为30 g/L的标本，观察30 d仍未见凝结。[结论]过氧化苯甲酰浓度为35 g/L的包埋剂对不脱钙骨组织包埋效果最为理想，应用本研究方法能为骨科基础研究领域相关研究提供有效的硬组织制作技术平台。
【关键词】 甲基丙烯酸甲酯; 不脱钙骨; 包埋
Application of MMA in the method of embedding the non-demineralized bone tissue∥TAN Jian-rong,YANG Xiao-hong,KANG Ning,et,al. Guangzhou Research Institute of Traumatology, the 4th Affiliated Hospital of Medical College of Jinan University,Guangzhou 510220, China
Abstract: To investigate the effect of the application of different concentrations of PMMA in embedded bone tissue by improving the producting process, it was aimed to look for the ideal embedded method of producing non- demineralized bone tissue samples. The specimens were fixed for 24 hours by 10% neutral formaldehyde,and dehydrated by concentration gradient alcohol,and then made transparent by xylene .They were shifted in UMMA solution with 15 g/L benzyl peroxide.The solution was changed per 24 hours.After these specimens were shifted in UMMA ,they were filtered for 30 min every day,in order to eliminate the gas in tissue.The specimens were divided into 3 groups of benzoyl peroxide's concentrations,which were 30 g/L,35 g/L,40 g/L respectively. The polymerization situation of the specimens were closely observed.Through comparing the setting time of three different concentrations,the result was clear:when the concentration of accelerator was 35 g/L ,the specimens began to condensate after 7 days and hardened gradually,the hardness of tissue and embedding medium were well-distributed.The results were satifactory.Two kinds of mimeral mark could be seen clearly while the sections were observed by fluorescence microscope;when the accelerator’s concentration was 40 gl,the specimens began to condese after 3～4 days and bubble was found which could affect the observation and making sections;the specimens which were made by accelerator of the concentration of 30g/L didn't condense after 30 days.When the benzoyl peroxide’s concentration is 35 g/L,the most satifactory results could be made.And this metheod can provide a platform for the research of basic orthopeadics.
Key words：methylmethacrylate; non-decalcificated osseous; tissue; embedding
组织学观察是骨科基础领域相关研究的重要方法之一，传统的石蜡包埋技术采用脱钙后石蜡包埋制作切片，在制作过程中，往往原有组织的形态、结构发生改变，无法精确地评估新骨的形成情况及骨组织与种植体的整合情况等。不脱钙骨包埋是骨科领域作为组织形态学观察及掌握骨的生长与钙化方向等信息的最佳方法[1、2]。但过去标本制作时间长，技术要求高，普通实验室难以开展。本研究改进既往包埋方法[3、4]，旨在探讨应用甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate, MMA)聚合包埋技术，对不脱钙骨组织标本进行包埋，评价不同浓度聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)对包埋效果的影响，寻找PMMA包埋的最佳浓度及时间。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 甲基丙烯酸甲酯(购自德国Merck公司)，荧光剂钙黄绿素及二甲苯酚橙均为Sigma产品，过氧化苯甲酰、二甲苯、氢氧化钠、氯化钠、无水氯化钙、乙醇均为广州化学试剂厂产品。
1.1.2 主要仪器
普通荧光图像采集用Zeiss Axiovert 200M 电动荧光显微镜，高压汞灯，绿色宽带滤片(#9，Zeiss)及红色宽带滤片(#15，Zeiss)，数码彩色CCD(电荷耦合器)摄像机(Camera AxioCam MRc Rev. 2，1388×1040，Zeiss);锯式切片机(Leica SP1600)。
1.1.3 实验动物
新西兰成年白兔购自广东省医学实验动物中心，在本所普通级动物实验中心进行常规饲养和观察。
1.2 方法
1.2.1 试剂配制
1.2.1.1 洗涤剂 称取氢氧化钠50 g，氯化钠200 g，加蒸馏水至1 000 ml溶解备用。
1.2.1.2 过氧化苯甲酰(市售试剂含水)使用前作干燥处理，将试剂盛于玻璃平皿，置干燥器待水分吸干备用。
1.2.1.3 MMA准备: (1)洗涤：洗去MMA单体中的阻聚剂，将MMA与洗涤剂按2∶1体积比加入分液漏斗，充分摇匀，静置分离，弃去下层，共2次;(2)用蒸馏水洗3次，方法同上;(3)吸水：无水氯化钙吸水30 min，过滤去水;(4)贮存：2～4℃保存。
1.2.1.4 UMMA配制：加速剂过氧化苯甲酰1.5 g溶于100 ml MMA中，浓度为15 g/L，2～4℃保存。
1.2.1.5 PMMA配制：按实验设定分别配制成加速剂过氧化苯甲酰浓度： 30 g/L、35 g/L、40 g/L，待加速剂完全溶解于MMA后，过滤置棕色瓶，2～4℃保存。
1.2.1.6 荧光染料配制：用于活体标记的钙黄绿素及二甲苯酚橙采用pH7.2磷酸盐缓冲液配制，并经无菌过滤后作活体标记皮下注射，使用剂量分别为10 mg/kg，90 mg/kg。
1.2.2 动物实验
18周龄成年雌性新西兰兔4只，体重3.5±0.5 kg，于处死前每隔2周皮下注射calcein green及xylenol orange各1次[5、6]，处死后，制备髌骨纵切面标本，用于观察MMA包埋的标本制作质量，评估手术后矿化区域光密度定量分析新骨的形成速率。
1.2.3 包埋方法
1.2.3.1 取材与固定：兔骨组织用10%中性甲醛溶液固定24～48 h。
1.2.3.2 脱水与透明：取出固定好的组织标本，流动水冲洗后进行梯度脱水及组织透明，操作如表1。表1 兔骨组织标本脱水透明步骤脱水及透明溶液时 间70%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ24 h×390%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ24 h×3100%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ24 h×3乙醇：二甲苯 Ⅰ、Ⅱ24 h×2二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ24 h×3二甲苯：UMMA Ⅰ、Ⅱ24 h×2UMMAⅠ、Ⅱ、Ⅲ24 h×3
1.2.3.3 加速剂最佳浓度选择：设定三种加速剂浓度进行包埋，分别为30 g/L、35 g/L、40 g/L，将标本及标签放置于预先制备好的带有底座的容器中，加入各浓度的PMMA包埋剂，抽真空30 min，待气泡完全排出，盖上瓶盖，用密封纸封口，轻放于冷水盘中，密切观察样本聚合情况。
1.2.4 标本处理
标本聚合后用锯式切片机(Leica SP 1 600)制作骨磨片，标本切片厚300μm [5]。
1.2.5 统计学方法 ：数据统计采用SPSS 13.0软件包对数据进行one-way ANOVA分析。
2 结果
2.1 三种浓度及聚合时间观察比较：加速剂浓度为35 g/L的标本，在25℃左右，约7 d时间开始凝结，并逐渐变硬，组织与包埋剂的硬度均匀，效果理想(如图1);加速剂浓度为40 g/L的标本，约3～4 d开始凝结，但出现大量气泡，影响观察及制片，效果欠佳;加速剂浓度为30 g/L的标本，观察30 d以上才见聚合。见表2。 表2 三种浓度的过氧化苯甲酰处理
2.2 荧光显微镜下观察组织切片质量
用本文方法进行不脱钙包埋制作后，选取较典型的切片作为例子，直接在荧光显微镜下观察，可见正常兔髌骨结构完整，两种矿化标记清晰，图像精美(如图2)。
3 讨论
组织学观察作为骨科学基础领域研究的重要手段之一，传统的包埋介质石蜡只能用于不含钙的组织。组织脱钙过程中往往原有组织的形态会发生形变，不能精确评估新骨的形成情况，很多敏感指标也难以检测。为克服这些缺点，应用MMA包埋技术制作不脱钙骨组织切片，能更好地保持细胞结构，不破坏骨组织结构和成分，为研究骨组织成分、骨形成及骨形态计量学提供保证[1、5]。 图1MMA包埋兔骨标本 图2正常兔髌骨标本横切面显示钙沉积，300 μm 厚骨切片，标尺100 μm;荧光显微镜照片×50，兔髌骨结构完整，两种矿化标记清晰可辨， 绿色-钙黄绿素;红色-二甲苯酚橙 在应用甲基丙烯酸甲酯包埋的操作过程中，标本的固定、脱水、透明、包埋和固化均对最终切片的质量有明显的影响。包埋后应立即抽真空，将组织内的空气排净，并促使MMA进入组织内。硬化过程保持循序渐进，将标本容器置于冷水盘中，使MMA的聚合发生在较低的温度下。若温度过高，可造成组织内产生大量气泡，出现废品，导致包埋失败[3]。本研究以三种不同浓度的加速剂分别对不脱钙包埋标本进行处理，其凝结时间之间有显著统计学差异。在实际工作中体会到，以30 g/L的加速剂处理标本时，凝结时间过长;而以40 g/L的加速剂处理标本时，却往往导致凝结速度过快，组织内气泡未能排净，以上两种浓度均明显影响包埋质量，而以35 g/L的加速剂处理标本时，凝结时间适中，能排尽气泡，最大程度上保持细胞结构，因而病理切片的观察效果最好。本研究对设定浓度反复实验证明：加速剂浓度的选择尤其重要，浓度选择适当与否，是不脱钙骨组织包埋是否成功的关键。杨、Qin等曾长期在兔骨-肌腱结点修复的实验中使用35 g/L加速剂浓度和本研究方法处理标本，取得良好的包埋效果[6～8]。
【参考文献】
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作者单位：暨南大学医学院第四附属医院，广州市创伤外科研究所 广州 510220