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【摘要】 内质网应激是一种各种理化因素引起的亚细胞的病理状态，与多种疾病的发病有关。目前，软骨细胞内质网应激的研究处于起始阶段，可能对类风湿性关节炎、骨性关节病等的发病过程有影响。有研究证实内质网应激能影响软骨细胞的分化，同时也抑制了软骨细胞的合成功能，减少异常蛋白的合成，减轻应激对细胞的损害。过度的内质网应激反应可以导致软骨细胞的凋亡，这是独立于Fas途径和NO途径的细胞凋亡途径。内质网应激有三条信号通路：ATF-6（activating transcription factor 6）、Ire1（inositol-requiring 1）和PERK（PKR-like ER kinase）。三条通路可以通过TRAF-2（TNF receptor-associated factor 2）和GADD153（growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153）启动细胞凋亡基因，使软骨细胞凋亡。因此，内质网应激可能通过影响软骨细胞的功能和存活状态导致疾病的发生，但具体机制还需要进一步研究。
【关键词】 内质网； 应激； 软骨细胞； 凋亡
Advanced research of effect of endoplasmic reticulum stress on chondrcyte∥YANG Xin, CAO Yong-ping, WEN Li-cheng,et al.Orthopedic Department,the First Affiliated Hospital of Peking University,Beijing 100034, China
Abstract: Endoplasmic reticulum stress (ERS) is a kind of subcellular pathological state, and associated with many diseases. Recently, the research of ERS on chondrocyte is at the beginning stage, and may be involved in pathogenisis of rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA). It has been proved that ERS can interfere the differentiation of chondrocyte, decrease the synthesis of abnormal protein, attenuate the injury of cell. But overreaction of ERS can cause chondrocyte apoptosis through an independent pathway without of Fas and NO. There are three signal transmission passages in ERS: ATF-6（activating transcription factor 6）、Ire 1（inositol-requiring 1）and PERK（PKR-like ER kinase）.The three protein molecules activate apoptotic genes by TRAF-2（TNF receptor-associated factor 2）and GADD153（growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153）, initiate the chondrocyte apoptosis. Therefore, ERS may effect the pathogensis of RA and OA by modulating chondrocyte function and inducing apoptosis, but more research are needed to reveal the mechanism.
Key words：endoplasmic reticulum; stress; chondrocyte; apoptosis
内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指由于各种原因使得细胞内质网发生功能紊乱，导致错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集以及Ca2+离子平衡紊乱的亚细胞器病理状态。内质网是重要的细胞器之一，其功能主要是膜蛋白和分泌性蛋白的折叠、蛋白质糖基化修饰、蛋白质的分泌等。各种理化因素，如紫外线、缺氧、营养物质缺乏、病毒、氧化应激等均可使内质网发生应激反应，激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和内质网相关性死亡等信号通路，使细胞的功能和存活状态发生变化，进一步影响机体的生理机制［1、2］。目前，胰腺、心肌和神经元等细胞的内质网应激已成为研究热点，为糖尿病、心肌缺血、退行性神经病变等疾病的发病机理提供了有力支持［3］。但ERS在软骨细胞中的研究较少。
软骨细胞是关节软骨内唯一的细胞成分，有支持关节软骨、维持软骨基质动态平衡的作用。由于软骨内无血管和神经的支配，软骨细胞的代谢只能通过渗透作用实现，因此软骨细胞对营养物质的缺乏、氧化物的聚集和机械性压力等应激因素很敏感。软骨细胞的存活状态和软骨基质代谢的平衡状态，直接影响着关节疾病的发生和发展。现已证实在类风湿性关节炎和骨性关节炎等关节疾病中有大量软骨细胞的凋亡［4、5］。另外，假性软骨发育不良和多发性骨骺发育不良等疾病与软骨基质中蛋白多糖的变异有关［6］。因此应激状态下软骨细胞在亚细胞水平的代谢状态已引起学者的注意。
1 内质网应激下软骨细胞的存活状态
在内质网应激的情况下，细胞可以通过各种机制减轻内质网应激造成的伤害。未折叠蛋白反应是典型的内质网应激下的细胞保护机制（图1）。蛋白激酶PERK（PKR-like ER kinase）是内质网膜蛋白，在非应激状态时和分子伴侣Bip（immunoglobulin binding protein）结合。内质网应激时，Bip结合未折叠蛋白，使PERK胞浆区的蛋白激酶活化。它可以磷酸化eIF2α（eukaryotic translation initiation factor 2α），下调细胞内大部分蛋白质的合成，使得异常蛋白产生减少，并高表达Bip等分子伴侣，减轻内质网应激反应［2、3、7］。如果长时间暴露在应激条件下，细胞可以高表达内质网应激蛋白，如Bip、GADD34（growth arrest and DNA-damage-inducible gene 34）、CADD153/CHOP（C/EBP homologous protein）和ATF4（activating transcription factor 4）等。这些特异性蛋白的高表达使得细胞的生长减慢，提高了细胞对应激的防御能力［3］。依霉素（tunicamycin，TN）可以阻止细胞内蛋白质正常折叠，毒胡萝卜素（thapsigargin，TG）是Ca2+-ATP酶的抑制剂，可以使未折叠或异常折叠的蛋白在软骨细胞内蓄积或使内质网内Ca2+稳定失衡［8］，所以常被用来制作软骨细胞内质网应激模型。Bonnie［6］选取青少年肋软骨细胞的不死细胞系C-28/I2在IL-1β（interleukin 1）、SNP（sodium nitroprusside）和依霉素条件下进行体外培养，证实了人体软骨细胞在依霉素条件下大量表达内质网应激的特异性蛋白，如GADD153、Bip和ATF-4等，SNP条件下表达有少量增加，IL-1β条件下无表达，RT-PCR证实了这一结论。Ling［8］的实验采用小鼠软骨细胞的不死细胞系和原代小鼠软骨细胞，制作糖缺乏和依霉素、毒胡萝卜素诱导的内质网应激细胞模型，在培养24和48 h后检测到GADD153的表达较对照组明显增高，并通过细胞计数发现内质网应激的软骨细胞增长速度明显低于对照组。此外软骨细胞中P21呈高表达，PCNA（proliferating cell nuclear antigen）呈低表达，提示细胞进入生长停滞期。Kwok［9］利用转基因技术制作了13del小鼠，使得X型胶原α1链在软骨细胞内不能正常折叠，从而在内质网中蓄积，产生内质网应激。该实验也证实在软骨细胞肥大区明显增宽，其上层的软骨细胞中内质网应激信号传导分子Xbp1（x-box-binding protein-1）、Bip和GADD153的mRNA呈高表达。并且此实验通过对PCNA,cyclin-D1,p57kip2的检测，证实了肥大区上层的软骨细胞开始进行细胞分化，但肥大区中下层的软骨细胞表现出增殖细胞的特点，说明该区域的软骨细胞重新进入细胞周期。在软骨和骨交界区出现大量核聚集的扁平长条形软骨细胞和小软骨细胞，高表达II型胶原α1、转录调节因子sox-9和生长因子Igf2等未成熟的肥大软骨细胞的标志。这种返祖和异常分化的现象，被认为这是软骨细胞在内质网应激下对细胞分化做出的调整，减少错误蛋白的合成，进而减轻内质网应激反应。
2 内质网应激下存活软骨细胞的功能变化
内质网应激中存活的软骨细胞在功能上会受到一定的影响。Ling［8］的实验中，阿利辛染色发现内质网应激条件下培养的软骨细胞与正常软骨相比有形态学变化，而且细胞周围显色的蛋白多糖明显减少，同时RT-PCR提示发生内质网应激的软骨细胞对II型胶原、蛋白聚糖和连接蛋白的mRNA表达明显受抑，并随应激时间的延长进一步下降，其中II型胶原表达受抑最明显。Ling［8］进一步使用sox-9转录调节因子证实内质网应激导致的软骨基质的减少是mRNA水平上的表达抑制。Bonnie［4］的实验提示依霉素能通过内质网应激明显抑制软骨细胞对II型胶原基因的表达，SNP和依霉素能明显降低软骨细胞对蛋白聚糖基因的表达。
图1软骨细胞内质网应激模式图
3 内质网应激对软骨细胞凋亡的影响
软骨细胞凋亡的具体机制目前还不十分清楚。目前研究较多的软骨细胞凋亡途径主要是Fas途径和NO途径。
Fas是软骨细胞表面的跨膜蛋白，与配体（Fas-L）结合，激活细胞内偶联的信息传导通路，通过P38MAPK（mitogen-activated protein kinase）和caspase-8作用，可引起软骨细胞凋亡。由于Fas-L在类风湿关节炎的关节滑膜中的表达与关节炎的严重程度成正比［10～12］，因此Fas途径可能是与滑膜炎症有关的细胞凋亡途径。NO途径是因为NO的蓄积使软骨细胞中线粒体呼吸链异常，膜电位下降，线粒体内电子运输障碍和ATP生成减少。线粒体膜通透性增加，释放细胞色素c，激活蛋白水解酶caspase-3，引起软骨细胞凋亡［13、14］。骨性关节炎患者关节软骨中NO水平高于正常人，并和关节炎的严重程度有关，且与软骨细胞凋亡百分比分布成正比。所以NO途径可能是和退行性病变相关的软骨细胞凋亡途径［15］。
近年对内质网应激的研究发现，内质网应激也可以诱导细胞凋亡，而且是独立的凋亡途径。在应激条件下，细胞可以整合应激反应，调动应激反应蛋白减轻应激因素对细胞的损伤，使内质网适应新的内环境要求；同时细胞表达的内质网应激蛋白如GADD153，caspase12等，也可以启动细胞凋亡来处理不能修复的损伤细胞［3］。Ling［8］的实验中小鼠软骨细胞系和原代小鼠软骨细胞在糖缺乏、依霉素和毒胡萝卜素三种应激条件下培养，24和48 h后检测到GADD153的表达较对照组明显增高，在软骨细胞系中caspase-12的表达也是明显增加。DNA碎片分析显示足够长时间的内质网应激能诱导软骨细胞凋亡，分解出DNA碎片，但不同的应激条件出现细胞凋亡的时间不同。实验还证实内质网应激软骨细胞内NO水平无明显增加，TNF-α和SNP处理的软骨细胞中无GADD153表达，IL-1β处理的软骨细胞有微量的GADD153表达。实验结果提示内质网应激相关的软骨细胞凋亡可能是独立于线粒体损伤的凋亡途径［8］。Bonnie［6］的实验中，SNP和依霉素条件下培养的软骨细胞中，凋亡细胞百分数明显高于对照组和IL-1β组。因此，内质网应激相关性死亡可能是软骨细胞凋亡的第三条途径，具体机制尚在进一步的研究中。现已证实内质网应激相关的凋亡促进分子主要有GADD153、caspase-12、Bax和Bak蛋白等；凋亡抑制分子主要有GPR78、ORP-150、BAP-31和Bcl-2等。其中GADD153是内质网应激与细胞凋亡的重要中间信号分子［16］。有文献指出，内质网应激未折叠蛋白反应可以激活ATF-6、Ire1（inositol-requiring 1）和PERK三条信号传导通路（图1）。ATF-6的激活可以促进GADD153的表达，GADD153可以抑制Bcl-2的表达，而Bcl-2能够减轻细胞对内质网应激的敏感性、保护使其免受GADD153引发的细胞凋亡。活化的Ire1α能聚集胞浆结合蛋白TRAF-2（TNF receptor-associated factor 2），后者可以使caspase-12前体分解产生caspase-12［2］。caspase-12这种内质网特有的活化蛋白水解酶激活胞浆内caspase-9和caspase-3，使细胞凋亡。同时，TRAF-2和GADD153均能够激活细胞内JNK信号通路，JNK能使转录因子c-JUN氨基末端磷酸化，调节下游与凋亡相关的基因表达［3］。PERK信号分子的激活可以磷酸化eIF2α，后者可以激活ATF-4，上调GADD153的表达和下调细胞内整体蛋白质的合成水平，包括细胞生存必需的蛋白质［2、3］。目前，人体尚未发现caspase-12［14］,但存在与其功能相似的蛋白激酶［16］。
综上所述，内质网应激可以影响软骨细胞的功能和分化，甚至可以诱导软骨细胞的凋亡，从而导致各种软骨细胞相关性疾病。目前已证实假性软骨发育不良、多发性骨骺发育不良和成骨不全等疾病与内质网内异常蛋白蓄积有关。此外，软骨退行性疾病，如骨性关节炎，已证实存在软骨细胞的糖代谢异常和软骨细胞凋亡的增加，因此内质网应激可能与骨性关节炎的发生和发展有一定的相关性。但软骨细胞内质网应激的具体机制以及软骨细胞凋亡途径的交叉作用等方面还需要进一步研究。
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作者单位：北京大学第一医院骨科，北京 100034