伊班膦酸钠对钛颗粒诱导的骨溶解作用

【摘要】  ［目的］通过建立钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解动物模型，研究伊班膦酸钠对骨溶解的影响，并探讨其作用机制。［方法］24只昆明系小鼠随机分成4组，每组6只，建立钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解模型。空白对照组进行假手术；钛颗粒组在小鼠颅顶植入30 mg钛颗粒；1单位伊班膦酸钠组和10单位伊班膦酸钠组分别于植入钛颗粒第2 d腹腔注射伊班膦酸钠10 mg、100 mg。手术后第10 d，取出颅骨进行病理学分析。［结果］空白对照组骨溶解面积为(0.070±0.009)mm2，没有发生明显骨溶解。钛颗粒组骨溶解面积为(0.369±0.050)mm2，和空白对照组相比发生了更大面积的骨溶解（P<0.05）。1单位伊班膦酸钠组和10单位伊班膦酸钠组骨溶解面积分别为(0.164±0.018)mm2、(0.018±0.075)mm2，均小于钛颗粒组骨溶解面积（P<0.05）。而且10单位伊班膦酸钠组比1单位伊班膦酸钠组骨溶解面积更小（P<0.05）。骨溶解区域破骨细胞数量各组比较结果和骨溶解面积结果类似。［结论］伊班膦酸钠能够有效抑制钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解。

【关键词】  人工关节； 无菌性松动； 骨溶解； 钛颗粒； 伊班膦酸钠

 Effects of sodium ibandronate on titanium particle induced osteolysis∥ZHANG Xuejun, WANG Chen, ZHANG Lei.Department of Orthopedics, Zhong Da Hospital, Southeast University,  Nanjing 210009, China

    Abstract：［Objective］Titanium  particle induced mouse calvarial osteolysis model was used to investigate the effects and mechanisms of sodium ibandronate on osteolysis.［Methods］Twentyfour Kunming species mice were randomly divided into 4 groups, 6 in each group. Control group received sham operation. Titanium particle group received 30 mg titanium particle implantation onto the calvariae. One unit sodium ibandronate group and 10 units sodium ibandronate group received 10 mg and 100mg sodium ibandronate ip injection separately on the next day of titanium particles implantation．Ten  days later，mice calvariae were harvested for pathology analysis.［Results］In control group osteolysis area was  (0.070±0.009)mm2 and osteolysis was not apparent. In titanium particle group osteolysis area(0.369±0.050) mm2 was bigger than that of control group(P<0.05). Osteolysis areas in 1 unit sodium ibandronate group(0.164±0.018) mm2 and 10 units sodium ibandronate group(0.018±0.075)mm2 were both smaller than that of titanium particle group（P<0.05）. And osteolysis areas in 10 units sodium ibandronate group was smaller than that of 1 unit sodium ibandronate group（P<0.05）. Osteoclast number in osteolysis area compared between groups had a similar result with osteolysis areas.［Conclusion］Sodium ibandronate can effectively inhibit titanium particle induced  mouse calvarial osteolysis.

    Key words：joint prosthesis；  aseptic loosening；  osteolysis；  titanium  particle；  sodium ibandronate

   人工关节置换术经过数十年的发展，目前已经是一项很成熟的骨科手术方式。然而，由于假体无菌性松动等原因，常导致人工关节置换术的失败。大约10%的患者在初次人工关节置换术后15年内需要进行人工关节翻修术［1］。到目前为止，尚无公认有效的药物能够预防或抑制假体周围骨溶解，而假体无菌性松动也只能通过关节翻修术进行治疗。二磷酸盐类作为抑制骨吸收的药物，临床已广泛应用于治疗骨质疏松症。近年来有不少关于二磷酸盐用于治疗假体周围骨溶解的研究，尚未见二磷酸盐用于临床治疗假体周围骨溶解的报道。本实验通过建立钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解动物模型，使用第3代二磷酸盐伊班膦酸钠进行干预，研究伊班膦酸钠对骨溶解的影响，并探讨其作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  主要材料和试剂

    伊班膦酸钠注射液（艾本），河北医科大学生物医学工程中心提供；钛颗粒，平均直径2～5 μm，美国Zimmer公司提供；显色基质鲎试剂盒，厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(Acid Phosphatase, Leukocyte，Procedure No.387)，美国Sigma公司提供。

    1.2  实验方法

    钛颗粒准备：钛颗粒先用无水乙醇浸泡48 h，高压蒸汽消毒30 min，37℃温箱烘干以去除内毒素。经显色基质鲎试剂盒检测，颗粒内毒素<0.25 Eu／ml。将颗粒每30 mg分装备用。

    小鼠颅骨骨溶解动物实验［2］：24只清洁级昆明系小鼠，全部为雄性，6周龄，平均体重24 g，随机分成4组，每组6只。分别为空白对照组,钛颗粒组，1单位伊班膦酸钠组和10单位伊班膦酸钠组。小鼠用戊巴比妥以45 mg/kg剂量进行腹腔注射麻醉。脱毛剂去除小鼠颅顶部毛，用0.5%的碘伏消毒小鼠颅顶部皮肤。作正中矢状位约1 cm切口，将预先准备的30 mg颗粒涂于暴露颅骨的中缝骨膜上，皮肤行间断缝合。空白对照组仅进行假手术而不植入钛颗粒。将小鼠置于12 h开关灯的清洁动物房内，自由摄食饮水。植入钛颗粒后第2 d，1单位伊班膦酸钠组，每只小鼠一次性腹腔注射伊班膦酸钠10 mg（按照小鼠与人体表面积折算等效剂量）；10单位伊班膦酸钠组，每只小鼠一次性腹腔注射伊班膦酸钠100 mg。

    标本处理和病理切片制作：手术后第10 d，过量麻醉处死小鼠。无菌条件下取出小鼠颅骨，取颅顶部约1 cm2方形骨片，去除表面软组织。10%中性甲醛中固定12 h, 然后用12.5%EDTA脱钙2周，石蜡包埋。每个组织蜡块作连续切片后，分别进行常规苏木精-伊红染色和抗酒石酸酸性磷酸酶染色。抗酒石酸酸性磷酸酶染色根据使用试剂盒说明书进行，用试剂盒中的各种试剂配制染色液并水浴加热至37℃，石蜡切片在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇脱水干燥后，将切片加入玻片染色缸内保持37℃避光孵育1 h。用去离子水充分洗涤切片，在苏木素中复染2 min，脱水，透明，中性树胶封固。

    观察指标数据获取：所有切片用Nikon ECLIPSE E600显微镜系统观察，×100倍条件下摄片。苏木精-伊红染色切片用Image-Pro Plus 6.0软件计算骨溶解面积。抗酒石酸酸性磷酸酶染色切片进行骨溶解区域内红染阳性破骨细胞计数。

    1.3  统计学处理

    数据用SPSS 11.0统计软件进行处理。所得数据用均数±标准差表示（±s）。骨溶解面积和破骨细胞数量的各组数据分别进行ANOVA分析后，再进行SNK检验。检验水准：α=0.05。

    2  结  果

    2.1  骨溶解面积

    苏木精-伊红染色见图1。空白对照组骨溶解面积为(0.070±0.009)mm2，没有发生明显骨溶解。钛颗粒组骨溶解面积为(0.369±0.050)mm2，和空白对照组相比发生了更大面积的骨溶解（P<0.05）。1单位伊班膦酸钠组和10单位伊班膦酸钠组骨溶解面积分别为(0.164±0.018)mm2和(0.018 ±0.075) mm2，均小于钛颗粒组骨溶解面积（P<0.05）。而且10单位伊班膦酸钠组比1单位伊班膦酸钠组骨溶解面积更小（P<0.05）(图3)。

    2.2  破骨细胞数量

    抗酒石酸酸性磷酸酶染色见图2。在骨溶解区域，红染的阳性细胞即为破骨细胞。空白对照组破骨细胞数量为(3.3±1.6)个。钛颗粒组在骨溶解区域有大量破骨细胞，数量为(19.0±3.4)个，多于空白对照组（P<0.05）。1单位伊班膦酸钠组和10单位伊班膦酸钠组破骨细胞数量分别为(10.8±2.5)个和(3.8±2.1)个，均少于钛颗粒组（P<0.05）。而且10单位伊班膦酸钠组比1单位伊班膦酸钠组骨溶解区域破骨细胞更少（P<0.05）(图4)。

    3  讨  论

    骨溶解作为人工关节置换术后严重并发症，其病因仍不明确，一般认为跟磨损颗粒、假体微动和应力等因素有关。

    在骨溶解的实验研究中，有学者对各种磨损颗粒进行了研究。Wooley等［3］通过建立小鼠皮下气囊模型（murine air pouch），利用超高分子量聚乙烯（ultra high molecular weight polyethylene，UHMWPE）、聚甲基丙烯酸甲酯polymethylmethacrylate，PMMA)、钴铬合金（cobalt chrome，CoCr）、和钛合金（titanium alloy， TiAlV）等颗粒进行实验，结果表明这些颗粒都能引起假膜组织显著增厚，其中钛合金颗粒的作用最强。Kaufman等［4］通过细胞培养研究UHMWPE、 TiAlV、 CoCr和铝颗粒（alumina particles）刺激巨噬细胞产生各种细胞因子发现，TiAlV颗粒刺激作用最强，和对照组相比能引起5～900倍细胞因子表达。

    本实验选用钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解动物模型，模拟人工关节磨损产生钛颗粒导致的假体周围骨溶解，在10 d之内成功诱导小鼠颅骨发生骨溶解。与空白对照组相比，钛颗粒组发生的大面积的骨溶解，骨溶解区域也产生了大量的破骨细胞，说明建立钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解动物模型是成功的。

    人工关节置换术后骨溶解的病因仍不明确，目前主流的磨损颗粒假说认为，各种类型的磨损颗粒会诱导的假体周围发生一系列生物学反应，导致骨溶解的发生。磨损颗粒被认为在骨溶解的发生和发展中起着关键性作用，有研究表明发生骨溶解的病例比未发生骨溶解病例有更多的磨损颗粒［5］。在假体无菌松动患者的骨与假体之间常存在“假膜”，显微镜下可以看到假膜里有巨噬细胞、成纤维细胞、破骨细胞等［6］。破骨细胞是从单核巨噬细胞系的破骨细胞前体细胞分化而来的多核细胞，是导致骨吸收最重要的细胞。磨损颗粒会刺激巨噬细胞产生大量促炎症介质和蛋白水解酶类，尤其是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）, 白介素1（interleukin-1, IL-1）, IL-6, IL-17, 巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor, M-CSF）等，介导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化，最终导致骨溶解［7］。陈志荣等［8］ 用钛颗粒刺激培养的巨噬细胞，用酶联免疫法(ELISA) 检测巨噬细胞分泌细胞因子的量，钛颗粒可以刺激巨噬细胞产生大量的TNF-α、IL-1、IL-6。本实验试图通过伊班膦酸钠对破骨细胞的抑制作用抑制骨溶解。实验证实伊班膦酸钠组骨溶解面积和破骨细胞数量均小于对照组。与对照的钛颗粒组相比，伊班膦酸钠组骨溶解面积缩小和破骨细胞数量减少有统计学意义，说明伊班膦酸钠发挥了抑制破骨细胞的作用，抑制了骨溶解产生，而且这种抑制作用与剂量呈正相关。10单位伊班膦酸钠组优于1单位组，在较大剂量伊班膦酸钠的作用下，骨溶解基本抑制，其骨溶解面积和破骨细胞数量和空白对照组无差异，提示10单位伊班膦酸钠组完全抑制了骨溶解的产生。实验给药剂量按照小鼠与人体表面积折算等效剂量为1单位，10单位组为10倍剂量，如此剂量虽然获得较好抑制骨溶解效果，但潜在的药物副作用不可忽视，因此，最佳剂量有待进一步实验研究。

    图1  苏木精-伊红染色（放大倍数100）  1a.空白对照组,1b.钛颗粒组，1c.1单位伊班膦酸钠组，1d.10单位伊班膦酸钠组  图2  抗酒石酸酸性磷酸酶染色（放大倍数100），2a.空白对照组,2b.钛颗粒组，2c.1单位伊班膦酸钠组，2d.10单位伊班膦酸钠组  图3  骨溶解面积（1～4分别为空白对照组,钛颗粒组，1单位伊班膦酸钠组和10单位伊班膦酸钠组）

    图4  破骨细胞数量

    实验提示，伊班膦酸钠具有抑制骨溶解效应，表现为骨溶解面积减小和破骨细胞数量减少，其抑制效应和剂量呈正相关关系。以往二磷酸盐抑制骨溶解的研究发现二磷酸盐具有抑制骨溶解的作用。马立峰等［9］认为髋关节置换术后病人可按常规剂量服用阿仑膦酸钠, 尤其术后第1年显得更加重要, 它对假体周围骨溶解、骨丢失有明显抑制作用。二磷酸盐类药物作用的靶细胞是破骨细胞，作用机制包括：抑制破骨细胞的骨吸收功能，促进破骨细胞的凋亡和抑制破骨细胞的形成［10］。伊班膦酸钠属于第3代二磷酸盐类药物，其抑制破骨细胞作用强，副作用少。作为一种已经上市的药物，伊班磷酸钠目前主要用于治疗伴或不伴有骨转移的恶性肿瘤引起的高钙血症，以及恶性肿瘤骨转移引起的骨痛。本实验中伊班磷酸钠通过抑制破骨细胞，从而抑制了骨溶解。伊班磷酸钠有望成为抑制假体周围骨溶解的药物而发挥新的功能。

【参考文献】
  ［1］ Teeny SM, York SC, Mesko JW, et al. Longterm followup care recommendations after total hip and knee arthroplasty: results of the American Association of Hip and Knee Surgeons' member survey［J］. J Arthroplasty, 2003, 8:954-962.

［2］ 张 亮，陈志荣，吴兴临，等. 依那西普对钛颗粒诱导小鼠骨溶解及破骨细胞增殖的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，9:1601-1604.

［3］ Wooley PH, Morren R, Andary J, et al. Inflammatory responses to orthopaedic biomaterials in the murine air pouch［J］. Biomaterials, 2002, 2:517-526.

［4］ Kaufman AM, Alabre CI, Rubash HE, et al. Human macrophage response to UHMWPE, TiAlV, CoCr and alumina particles: analysis of multiple cytokines using protein arrays［J］. J Biomed Mater Res A, 2008:2:464-474.

［5］ Dumbleton JH, Manley MT, Edidin AA. A literature review of the association between wear rate and osteolysis in total hip arthroplasty［J］. J Arthroplasty, 2002,5: 649-661.

［6］ Morawietz L, Classen RA, Schrder JH, et al. Proposal for a histopathological consensus classification of the periprosthetic interface membrane［J］. J Clin Pathol, 2006, 6:591-597.

［7］ Neale SD, Sabokbar A, Howie DW, et al. Macrophage colonystimulating factor and interleukin6 release by periprosthetic cells stimulates osteoclast formation and bone resorption［J］. J Orthop Res, 1999,5:686-694.

［8］ 陈志荣,张 亮,吴兴临,等. 依那西普对磨屑诱导骨溶解影响的实验研究［J］.中国矫形外科杂志,2008，4:285-287.

［9］ 马立峰, 郭 艾. 双磷酸盐对人工髋关节置换术后早期假体周围骨密度的影响［J］.中国矫形外科杂志,2007,4:270-271.

［10］廖 晖，李 锋. 二磷酸盐抑制骨吸收作用机制的研究现状［J］.生物骨材料与临床研究,2004,2:20-24.

作者单位：东南大学附属中大医院骨科,江苏 南京，210009