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【摘要】 ［目的］探讨不同强度恒磁场促进顺铂诱导的U2骨肉瘤细胞（U2-OS）细胞凋亡及p53、bcl-2、c-myc基因表达变化的情况。［方法］分别使用1 mT、10 mT、100 mT恒磁场和加入3.0 μg/ml顺铂的细胞培养液共同培养U2-OS细胞24 h。采用四甲基氮唑蓝比色法（MTT法）、流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测恒磁场和顺铂联合对U2骨肉瘤细胞体外增殖、凋亡及相关基因表达。［结果］不同强度恒磁场能促进顺铂对人U2-OS细胞的抑制作用，10 Gs场强下其抑制率、凋亡率最高；凋亡率达37.66%，而p53 mRNA表达最强，bcl-2、c-myc mRNA表达最弱。［结论］不同强度恒磁场协同顺铂通过诱导细胞内p53、bcl-2、c-myc基因表达的变化是其抗肿瘤的机制之一，10 Gs场强下协同顺铂的抗肿瘤作用最强。
【关键词】 骨肉瘤； 化疗； 恒磁场； 凋亡机制
Molecular mechanism of constant magnetic fields plus cisplatin for apoptosis in U2-OS cells∥DAI Min,ZHAN Ping, XIONG Gao-fei, et al. Department of Orthopaedics ,the First Affiliated Hospital,College of Basic Medical Sciences,Nanchang University, Nanchang 330006, China
Abstract: ［Objective］To approach the expression of p53，bcl-2，c-myc genes and apoptosis induced by cisplatin associated with constant magnetic field at different intensities in U2-OS cells. ［Methods］Constant magnetic field at different intensities (10Gs, 100Gs, 1 000Gs), cell culture fluid including 3.0μg/ml cisplatin were used to culture U2-OS cells for 24 h. MTT, RT-PCR, flow cytometry(FCM)were used to evaluate tumor cell proliferation,gene expression and apoptosis in vitro.［Results］Constant magnetic field at different intensities promote the inhibitory effect of cisplatin. The effect of cisplatin with 10Gs constant magnetic field made the maximum inhibition rate and the apoptosis rat. The apoptosis rate was 37.66%. RT-PCR showed maximum p53 expression,and minimum bcl-2,c-myc expression.［Conclusion］Constant magnetic fields at different intensities promote plus cisplatin can induce p53, bcl-2 and c-myc expression. Ten Gs of constant magnetic field has the strongest antineoplastic effect.
Key words：osteosarcoma; chemotherapy; constant magnetic field; apoptosis
顺铂做为一种公认的抗骨肉瘤化疗方案中一线药物，在临床上使用广泛。但越来越多的化疗耐药及对化疗不敏感的病例出现使骨肉瘤治疗疗效停滞不前。通过研究不同强度的恒磁场对顺铂作用的人U2-OS细胞凋亡的分子机制，为提高骨肉瘤对化疗的敏感性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 （1）细胞来源及其培养：人U2-OS细胞株购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，在含5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中，用含10%胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM培养基（HyClone公司）培养，用0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）消化传代。（2）药物和主要试剂：顺铂为Sigema公司实验用试剂，用生理盐水配制成1mg/ml的储存液，使用时用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释成3.0 μg/ml浓度。噻唑蓝 ( MTT )购于上海普飞生物技术有限公司。DMSO试剂购于Sigema公司。TRIzol试剂产自Invitrogen公司。DEPC产自Ameresco公司。M-MLV Reverse Transcriptase、Rnasin、dNTP、Oligo(dT)15均产自Promega公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 分组及处理 细胞呈对数生长后，实验分组为：①空白对照组；②阳性对照组：加入顺铂浓度3.0 μg/ml的细胞培养液；③实验组1∶加入顺铂浓度3.0 μg/ml的细胞培养液+1 mT恒磁场共培养；④实验组2：加入顺铂浓度3.0 μg/ml的细胞培养液+10 mT恒磁场共培养；⑤实验组3：加入顺铂浓度3.0 μg/ml的细胞培养液+100 mT恒磁场共培养，作用时间为24 h。
1.2.2 四唑蓝比色法（MTT法） 取对数生长期 U2-OS细胞经胰酶消化后计数,调整细胞密度为 5×104/mL,接种于96孔板,每孔100 μL。设调零组、①②③④⑤组,每孔设5复孔,按上述方法处理细胞后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL,继续孵育4 h,每孔加入200 μL的二甲基亚砜(DMSO)终止,然后再振荡15 min, 450型 ELISA- Reader酶标仪490 nm主波长, 572 nm副波长检测吸光度。重复实验3次。以空白对照组细胞活力为100%,按公式计算对U2-OS细胞增殖的抑制率。公式：细胞抑制率(%)=(1-药物组吸光度/对照组吸光度)×100%。
1.2.3 流式细胞术检测凋亡 用胰酶消化收集上述各组细胞，应用FACSCalibar流式细胞仪（Beckton Dickinson ,USA）分析，氩离子激光器激发波长为488 nm，在流式细胞仪上进行细胞周期分析，得出细胞凋亡百分率。
1.2.4 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR法） 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR法）检测各组细胞mRNA表达（图1）。采用Trizol试剂提取细胞总RNA，合成cDNA。 PCR扩增p53、c-myc和bcl-2应用Primer Primier 5软件设计引物，由上海生工生物工程公司合成, p53上下游引物分别为5’-TGGAGGATTCACAGTCGG-3’及5’-GGTGGAAGCCATAGTTGC-3’，扩增产物187bp；c-my上下游引物分别为5’- AGAGTTTCATCTGCGACCCG -3’及5’-GCTGCGTAGTTGTGCTGATGTG-3’，扩增产物595bp；bcl-2上下游引物分别为5’-TGTGCCTGTAAACATAGATTCGC-3’及5’-CTTCCAGACATCGGAGACCA-3’，扩增产物742bp；同一标本扩增以β-actin做为内参照。β-actin上下游引物分别为5’- ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3’及5’-AGGGGCCGGACGCGTCATACT-3’，扩增产物621 bp。 PCR通过94℃预变性5 min,94℃ 45 s，55℃ 60 s，72℃ 45 s，35个循环后72℃终末延伸10 min。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳(含5mg/L溴化乙锭)后,在紫外灯下观察结果。通过FR200图像分析软件（上海复日公司）读取目的电泳条带的斑点密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值为标准，测算其相应组的p53、c-myc、bcl-2 mRNAs的表达量。
1.2.5 统计学方法 采用SAPSS 13.0统计软件进行统计分析，实验数据用x-±s表示，组间比较采用方差分析。
2 结果
2.1 各组细胞体外增殖抑制实验
MTT检测显示磁场强度为1 mT的实验组细胞增殖显著低于对照组及磁场强度为10 mT、100 mT的实验组（P＜0.05）。各组A值及抑制率见表1。表1 不同强度恒磁场协同顺铂作用后U2-OS增殖抑制结果组别*与实验组2、3比较有统计学差异，P＜0.05；△与对照组比较有统计学差异，P＜0.05
2.2 流式细胞仪检测凋亡率
③组较②④⑤组凋亡率明显增多（P＜0.05），①～⑤组凋亡率分别为0%、21.19%、37.66%、30.71%、27.81%。
2.3 RT-PCR结果
各组细胞p53、c-myc和bcl-2 mRNAs表达量与β-actin mRNAs条带扫描值对比发现， p53表达量以③组最高；c-myc和bcl-2表达量③组最低，③组与①②④⑤组比较有组间差异，具有统计学意义(P＜0.05)。而②组与④⑤组间比较p53表达量增高，c-myc和bcl-2表达量降低，组间比较有统计学意义（P＜0.05）。见表2。
图1p53、bcl-2、c-myc mRNAs表达图
3 讨论
骨肉瘤是一种好发于青少年长管状骨干骺端的原发恶性肿瘤，其恶性程度高，致残率、致死率高。虽然自“新辅助化疗”概念提出后，骨肉瘤5年的无瘤生存率由原来单纯手术的20%提高到目前的70%～80%［1］，顺铂更是骨肉瘤化疗中最常用的药物之一［2］，但目前骨肉瘤患者的治疗进入了平台期，化疗药物疗效难以提高。随着磁生物学效应研究的开展,人们已经把目光投向了磁场对肿瘤的生物学效应特别是对肿瘤的抑制效应，通过恒磁场及化疗药物的协同作用能否提高化疗药物抗肿瘤作用备受关注。
Sabo等［3］在研究稳恒磁场对HL-60细胞的影响时发现，1T稳恒磁场作用72h后不仅可以降低癌细胞的活性,还可以增强抗癌药物对癌细胞的细胞毒作用，但机制尚不明确。Tenuzzo等［4］实验表明用6 mT恒定磁场处理HeLa等多种肿瘤细胞后，检测到肿瘤细胞内Ca2+离子浓度升高。而Ca2+离子浓度升高能抑制bcl-2的表达，促进bax蛋白的表达增高，Bcl-2/bax的比值减小，认为这是诱导肿瘤细胞凋亡的原因之一。刘华等［5］用全长P53 cDNA作探针检测经磁场处理和未经处理的肿瘤细胞p53基因扩增、重排、缺失、转录和表达时发现：恒强磁场引起的荷瘤大鼠肿瘤细胞凋亡同p53 基因转录和表达增强有关，表现出P53依赖性凋亡的特点。这些研究反映了磁场作用于基因而间接影响肿瘤增殖和凋亡状态的作用路线。表2 RT-PCR结果分析表空白对照组阳性对照组实验组1实验组2实验组3p53/β-actin0.514±0.0080.665±0.0090.684±0.007*0.642±0.0080.591±0.007bcl-2/β-actin0.681±0.0140.624±0.0100.461±0.003*0.492±0.0060.550±0.005c-myc/β-actin0.883±0.0070.768±0.0040.637±0.002*0.680±0.0070.646±0.003* 与其他各组比较均有统计学差异，P＜0.05 本研究发现，不同强度稳恒磁场协同顺铂作用于U2-OS细胞24 h能促进细胞凋亡的发生，这种作用是通过促进p53基因的表达，p53基因表达的增强能特异性上调bax基因表达，导致骨肉瘤细胞凋亡增加［6］。同时稳恒磁场的作用能抑制bcl-2的表达促进凋亡，此结果和Tenuzzo等研究结果相似。作者也发现稳恒磁场作用也能抑制c-myc基因的表达而抑制骨肉瘤细胞的增殖。这可能是稳恒磁场促进化疗药物作用中的基因表达作用的一部分。
但是到目前为止,磁场作用的理论还很不完善,我们发现10 mT和100 mT稳恒磁场并没有显现出和1 mT稳恒磁场同等强度的协同作用，10 mT和100 mT稳恒磁场组之间比较无显著差异。陈淼等［7］研究显示，经稳恒磁场处理后,微血管数量、面积、密度均明显降低,证明了稳恒磁场可以通过减少供血量来达到抑制肿瘤的作用。稳恒磁场还可以延缓肿瘤细胞由S期进入G2期的进程,使S相细胞增多而使肿瘤细胞不能进入细胞分裂增殖期，从而促使细胞凋亡［8］ 。虽然稳恒磁场协同抗肿瘤作用的机理多种多样，但是因为磁场作用效果不仅和磁场参数包括磁场类型、场强大小、均匀性、方向性、作用时间等参数密切相关，还与肿瘤细胞种类、敏感性、作用部位等密切相关，所以至今尚未形成一个完善的磁场作用理论［9］。因此，要将稳恒磁场作为一种治疗手段推向临床还有待于进一步实验研究以及理论探讨。
【参考文献】
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［4］ Tenuzzo B,Chionna A,Panzarini E,et al.Biological dffects of 6mT static magnetic fields: a comparative study in different cell types［J］.Bioelectromagnetics，2006,7:560-577.
［5］ 刘华,任嘉诚,郭佑民,等.恒强磁场下的大鼠肿瘤细胞凋亡和P53基因的关系［J］.中国法医杂志,2003,18:3-6.
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［7］ 陈淼,丁翠兰,张云欣,等. 磁场作用于肿瘤组织中微血管定量关系的实验研究［J］.中国微循环,1999,3:147-148.
［8］ Junji M. Effects of static magnetic fields at the cellular level ［J］.Prog Biop &Mol Biol, 2005, 87:213-223.
［9］ McKinlay AF,Repacholi MH.More research is needed to determine the safety of static magnetic fields［J］. Prog Biop & Mol Biol,2005,87:173-174.
作者单位：南昌大学 a 第一附属医院骨二科，b 基础医学院生理教研室，江西南昌 330006