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【摘要】 [目的]研究和比较氧化铝陶瓷和高分子聚乙烯磨损颗粒在air-pouch动物模型体内诱导基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)产生及表达变化,探讨在不同磨损颗粒作用下明胶酶表达规律及其在人工假体无菌性松动病理过程中的意义。[方法]构建小鼠air-pouch动物模型。实验组分别注射氧化铝陶瓷颗粒悬液3 ml (A组)和高分子聚乙烯颗粒悬液3 ml (B组) ,对照组注射磷酸盐缓冲盐水3 ml。分别于注射后第3、7、14 d后各处死动物8只取出air-pouch囊壁组织，光镜下细胞计数反映炎性细胞浸润和增殖程度,半定量RT-PCR及免疫组织化学染色法观察MMP-2、MMP-9基因及蛋白表达量的变化。[结果]实验组炎性细胞计数、MMP-2、MMP-9基因表达量和MMP-2、MMP-9阳性细胞率差异均有显著性(P<0.05);且各时间点B组均高于A组(P<0.05);第14 d时,B组明显高于A组(P< 0.01)。[结论]两种磨损颗粒均能诱导MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白的表达,并且高分子聚乙烯颗粒组高于氧化铝陶瓷磨损颗粒组。
【关键词】 磨损颗粒; 无菌性松动; 骨溶解; 基质金属蛋白酶2; 基质金属蛋白酶9
Expression of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 9 induced by wear particles∥DAI Min, QI Qi-hua,CHENG Tao, et al.Department of Orthopaedics, the 1st Affiliated Hospital of NanChang University, Nanchang, Jiangxi 330006, China
Abstract: To compare the expression of matrix metalloproteinase 2(MMP-2) and matrix metalloproteinase 9(MMP-9) induced by alumina and ultra-high-molecular-weight polyethylene (UHMWPE) wear particles,and investigate the role of MMP-2 and MMP-9 in the mechanism of the periprosthetic osteolysis induced by wear debris during aseptic loosening. Seventy-two Kunmin mice were divided into 3 groups (24 per group) in a murine air pouch model of inflammation. The air pouches were injected with 3ml of suspension containing 1×108 /ml alumina particles in group A, while UHMWPE particles in group B, and control pouches received 3ml of sterile PBS.All animals were sacrificed at 3、7、14 days after injection. Histological changes and cell counting were assessed by light microscope.RT-PCR and immunohistochemistry method were applied to detect the gene and protein expression of MMP-2 and MMP-9 in the pouches.Increased cell infiltration and MMP-2,MMP-9 mRNA and immunoreactivity expression were detected in group A and B,and compared to control group,cell number and gene and protein expression of MMP-2 and MMP-9 in group A and B was significantly higher (P< 0.05).Expression of MMP-2 and MMP-9 in group B was significantly higher than that in group A at all time points (P<0.05).Expression of MMP-2 and MMP-9 in group B was higher than that in group A at 14 Day (P< 0.01)Both alumina ceramic and UHMWPE particles may result in different characteristics of the cellular response and gene expression at different timepoint and the expression increased with time within two weeks.In addition, expression for MMP-2 and MMP-9 in inflammatory membrane provoked by UHMWPE particles was higher than that in inflammatory membrane provoked by alumina ceramic.MMP-2 and MMP-9 would be invovled in the pathogenesis of aseptic loosening.
Key words：wear debris; aseptic loosening; osteolysis; MMP-2; MMP-9
假体周围骨溶解导致的无菌性松动是影响人工关节长期稳定性和使用寿命的主要原因。大多数学者认为，由磨损颗粒诱导的炎症介质的释放而引起的破骨细胞性骨吸收可能是人工关节假体周围骨溶解的主要发病机制[1、2]。人们在无菌性松动假体周围检测到大量的炎性介质和水解酶类如：如肿瘤坏死因子(TNF-ɑ)、白介素1(IL-1)、过氧亚硝基阴离子、前列腺素E2(PGE2)、基质金属蛋白酶(MMPs) [3]。明胶酶包括基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)，可以降解骨基质支架结构，并参与破骨细胞的分化成熟，可能在无菌性松动的发病机制中起重要作用。本研究通过air-pouch动物模型模拟假体周围微环境，研究暴露于不同类型的磨损颗粒air-pouch囊壁组织中明胶酶表达变化，明确明胶酶参与了炎症反应的同时，观察不同种类磨损颗粒对明胶酶产生的影响，探讨其在假体无菌性松动中的意义。
1 材料与方法
1. 1 磨损颗粒的准备 体外加工获得氧化铝陶瓷和高分子聚乙烯颗粒，氧化铝陶瓷颗粒近似球形的菱形，短径平均粒径0.70 μm, 长径平均粒径1.17μm,;高分子聚乙烯颗粒外形近似球形，平均粒径9.26 μm。颗粒用环氧乙烷消毒，将消毒后的颗粒分别以100 ml PBS配成108个/ml浓度的颗粒悬液。经显色基质鲎试剂盒(卫药准字SJ202号050904)检测颗粒悬液样本内毒素含量<0.02 EU/ml。
1. 2 材料 TRIzol为美国Invitrogen公司产品，RT-PCR试剂盒为美国Promega公司产品，MMP-2、MMP-9、B-actin引物由中国上海生工合成，兔抗MMP-2多克隆抗体、兔抗MMP-9多克隆抗体均为美国Santa Cruze公司产品，辣根过氧化酶/FITC /标记羊抗兔IgG为北京中杉桥公司产品。其它试剂均为进口或国产分析纯。
1. 3 动物的分组及模型的构建 取健康昆明系小鼠72雌雄不限，体重20～25 g (南昌大学医学院实验动物科学部提供,清结级) 。A组：24只，注射氧化铝陶瓷磨损颗粒悬液; B 组：24只，注射高分子聚乙烯颗粒悬液;对照组：24只，注射PBS。参照Yang等[4]方法构建air-pouch动物模型，air-pouch动物模型构建成功。按分组分别将3 ml颗粒悬液(超声分散后)或PBS注入air-pouch动物模型体内，分别于注射后3、7及14 d，每组脱颈椎各处死8只，采集囊壁组织，留备检测用。
1.4 观察和检测指标
1.4.1 RT-PCR检测MMP-2、MMP-9基因的表达 按Trizol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，各引物序列见表1，所有反应体系按以下条件进行反应：预变性94℃ 5 min,变性94℃ 30 min,退火60℃ 30 s,延伸72℃ 30 s，进行35个循环,最后72℃延伸10 min。用全自动凝胶分析系统灰度扫描分析，结果以目的基因与β-actin基因扩增片段的灰度之比表示。
1.4.2 免疫组织化学检测MMP-2、MMP-9蛋白表达 将囊壁组织常规石蜡包埋、切片、常规行HE染色，光学显微镜下细胞计数反映炎性细胞浸润和增殖程度。免疫组化石蜡切片，常规脱蜡及脱水，3% H2O2 及10%正常山羊血清封闭后，热抗原修复，加入一抗4℃过夜，加二抗及显色，按说明书进行操作。采用Nikon荧光显微照相系统拍取图像，高倍视野(×400)下每张片随机选取6个阳性细胞数最多的视野，计算出平均阳性细胞百分数。
表1 各引物序列及扩增产物长度引物名称引物序列PCR产物大小MMP-2上游：5-ATGCGGAAGCCAAGATGTG-3126bp下游：5-GTCCAGGTCAGGTGTGTAAC-3MMP-9上游：5-TGAGTCCGGCAGACAATCC-3432bp下游：5-CCTTATCCACGCGAATGACG-3β-actin上游：5-CTCTCAGCTGTGGT-3216bp下游：5-AGCCATGTACGTAGC-3
1.5 图像分析和统计学处理 各组灰度比值及细胞阳性率均应用SPSS 12.0软件包进行统计,灰度比值及细胞阳性百分率采用x-±s表示，均数比较用单因素方差分析。
2 结果
2. 1 肉眼和光镜下观察 动物处死后于皮下可见囊腔组织与周围组织有明显的境界，呈椭圆状，易于剥离，边缘光滑。A组和B组囊腔较大呈乳白色,质地较脆，对照组呈扁平略透明滑膜状。B组的范围明显大于A组,对照组明显小于前两组。切开囊腔，可见A组和B组的囊壁较厚，对照组薄而略透明。与对照组比较, A组和B组光镜下均可见囊壁靠近囊腔处有大量巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润和增殖，少量成纤维细胞,囊壁外层靠近皮下主要为成纤维细胞。对照组囊壁内层为隐约可见巨噬细胞等炎性细胞。囊壁组织细胞计数结果表明，各时间点实验组(A组和B组)均高于对照组(P< 0.05)，B组均明显高于A组和对照组(P<0.05) 。见表2。表2 炎性细胞计数结果
2.2 囊腔组织中MMP-2、MMP-9 mRNA的表达
各组均可见MMP-2、MMP-9 mRNA的表达，对照组表达量较低，A组和B组表达量较高，且随实验时间的推移而增多，在14 d达高峰。各时间点实验组(A组和B组)MMP-2、MMP-9 mRNA表达量均高于对照组(P< 0.05)(图1a、b)(图2a、b)，B组均高于A组(P< 0.05)。B组MMP-9 mRNA的表达在14 d组明显高于A组(P<0.01)。
2. 3 免疫组织化学MMP-2、MMP-9的阳性表达 MMP-2、MMP-9阳性细胞的胞浆内有染色程度不同棕黄色或褐色颗粒。光镜下实验组(A组和B组)存在大量MMP-2、 MMP-9染色阳性细胞,对照组仅极少数染色阳性细胞。与对照组相比,各时间点实验组MMP-2阳性细胞百分率差异均有显著性(P< 0.05)(图3、表3)。与对照组相比,各时间点实验组MMP-9阳性细胞率差异均有显著性(P< 0.05) ,第14 d时B组明显高于A组(P< 0.01) (图4、表4)。 图1MMP-2 mRNA半定量凝胶照片,泳道1：3 d组;泳道2：7 d组;泳道3：14 d组;泳道4：标准DNA(100bp) 图2MMP-9 mRNA半定量凝胶照片，泳道1：标准DNA(100bp);泳道2：14 d组;泳道3：7 d组;泳道4：3 d组表3 MMP-2阳性细胞百分率(%, x ±s, n = 8)组别3 d7 d14 d对照1.749 ±0.1472.346 ±0.2532.734 ±0.193A3.843 ±0.572△8.246 ±1.956△15.016 ±2.809△B5.124 ±0.67913.423 ±2.92725.663 ±3.931与对照组比较：△P<0.05表4 MMP-9阳性细胞百分率
图3高分子聚乙稀组MMP-2表达阳性细胞的胞浆内有染色程度不同的黄褐色或褐色颗粒(SP法10×400) 图4高分子聚乙稀组MMP-9表达阳性细胞的胞浆内和细胞外有染色程度不同的黄褐色或褐色颗粒(SP法10×40)
3 讨论
假体周围无菌性松动被认为是制约人工关节置换术后假体使用年限、导致假体固定失败的主要远期并发症。磨损颗粒刺激假体周围活性细胞活化，产生大量的炎性介质及细胞转导因子，通过多重级联反应活化假体周围破骨细胞，破骨细胞释放大量的水解酶产生溶骨效应[5]。明胶酶作为假体周围的主要水解酶之一，它可降解骨组织基质支架，又可作为信号分子促进破骨细胞的分化成熟。明胶酶可在胶原分子链的Gly-Leu链处切割胶原产生3/4和1/4原长的胶原片段。Engsig等[6]研究认为MMP-2、MMP-9降解胶原产物可趋化破骨细胞前体细胞或破骨细胞向成骨细胞聚集，诱导破骨细胞成熟分化。Yuki Kaneshita等[7]研究表明MMP-9抑制剂GM6001(伊洛马司他)可以抑制RANKL刺激破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化的能力。人们在无菌性松动翻修假体周围发现大量的MMP-2、MMP-9表达[8、9]。
本实验研究表明，在磨损颗粒的刺激下，A、B组炎性细胞计数和MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白的表达量在2周之内随着时间的推移明显增加，而对照组未见明显组织细胞学反应，仅极微量MMP-2、MMP-9 mRNA的表达和少数免疫组化染色阳性细胞，说明磨损颗粒是明胶酶产生的诱因。聚乙稀颗粒组在各时间点MMP-2、MMP-9基因及蛋白的表达明显高于氧化铝陶瓷组，说明明胶酶的产生与颗粒种类有关。假体周围的磨损颗粒的产生是持续的，假体周围炎症反应过程是颗粒刺激下急性无菌性炎症与慢性无菌性炎症交替持续存在的，因此本实验选取2周作为观察时间范围，既能够观察到急性炎性反应过程也能观察到慢性炎性过程。实验观察到随着时间的推移炎症反应逐渐加强，这与作者前期研究是一致的[10]。
通过模拟人工关节假体周围由磨损颗粒诱导的慢性炎症反应，进一步证实了基质金属蛋白酶参与了慢性炎症的发生、发展过程，在骨有机质的降解和假体周围破骨细胞的活化、迁移过程中起重要作用，这与对关节翻修假体周围取出的界膜组织实验结果是一致的。同时还发现，在排除颗粒浓度和内毒素的影响,从颗粒种类、大小等角度来看,笔者认为粒径较大的高分子聚乙烯颗粒生物活性高于颗粒粒径较小的氧化铝陶瓷颗粒。过量MMP-2、MMP-9的表达影响假体周围微环境的成骨细胞、破骨细胞、单核/巨噬细胞(破骨细胞的前体细胞)的分化与活化, 加速破骨细胞穿过类骨质移动到矿化骨表面，抑制骨生成,促进骨重吸收,使骨形成代谢(由合成骨基质的成骨细胞完成) 和骨吸收代谢(由吸收骨基质的破骨细胞完成) 动态平衡失调,最终导致假体周围骨溶解的产生。进一步对MMP-2、MMP-9表达的研究为加深对假体周围骨溶解发生的认识提供了理论基础，也为对假体周围无菌性松动的防治提供了一种新的思维、新的途径。
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作者单位：1.南昌大学第一附属医院骨二科，江西南昌 330006;2.上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海市 200233