神经生长因子促进周围神经血管形成的实验研究

【摘要】  [目的]探讨神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在大鼠坐骨神经再生过程中促进血管形成的作用。[方法]利用自行研制的梭形双通道桥接管桥接36只SD大鼠坐骨神经长10 mm缺损。将动物随机分为2组，A组：医用几丁糖凝胶组;B组：医用几丁糖凝胶+NGF和医用几丁糖凝胶+睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)。术后4、8、16周观察再生神经的大体形态，并用HE染色和透射电镜观察再生神经的束间及束内血管分布。[结果]A组2支管内再生神经大体观察无明显差异，B组NGF侧再生神经外观呈粉红色或淡红色，质脆，弹性差;CNTF侧再生神经呈淡黄性，质韧，弹性佳。HE染色见NGF侧再生神经较CNTF侧再生神经排列紊乱，其束间及束内的血管较多见;超微结构示：B组NGF侧再生神经较少，但可见较多的成纤维细胞和丰富的新生血管。[结论]虽然NGF对周围神经再生的促进作用不及CNTF，但其在神经再生的早、中、晚期均具有较为明显的血管形成作用，其作用机制可能与成纤维细胞增殖密切相关。

【关键词】  梭形双通道桥接管; 神经生长因子; 周围神经再生; 血管形成

Morphological study on the angiogenesis of peripheral nerve affected by nerve growth factor∥LI Qiang,WU Yamin,SHEN Tugang,et al.Center of Orthopedics and Traumatology,98th Hospital of PLA,Huzhou 313000,China

　　Abstract：To discuss the effects of angiogenesis about nerve growth factor(NGF) during the peripheral nerve regeneration.Thirtysix SpragueDawley rats with 10mm gap of sciatic nerve were randomly divided into two groups which had been bridged with the new double channel nerve conduit of fusiform shape.Each group contained eighteen animals,in the first group,200 μl of chitin for medical use was injected into the conduit,in the second group,the two branches of the conduit contained 100 μl of the chitin and 5 μl NGF or ciliary neurotrophic factor(CNTF).At four,eight or sixteen week after operation,the angiogenesis of NGF was evaluated with Hematoxylin and Eosin(HE) staining and electron microscope.There were not significant differences of the regenerative nerve fibres between two channels in the first groups,but in the second group,the regenerative nerve of NGF branch channel was red,crisp and the nerve of CNTF branch channel was yellow and tenacious.HE staining showed that there were much more new vessel in the regernerative nerve tract of NGF the branch channel,and the regernerative nerve fibre was disorder,there were much more fibroblasts and vessels observed under eletron microscope.NGF can significantly promote the angiogenesis during the peripheral nerve regeneration,the mechanism may be related to fibroblast.

　　Key words：double channel nerve conduit of fusiform shape; nerve growth factor; peripheral nerve regeneration; angiogenesis

　神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)是最早被发现，且研究较深入的神经营养因子，其对神经系统发育、维持神经元存活和神经损伤后的修复均有重要作用。近年来研究还发现NGF可通过增加血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，促进血管内皮细胞增殖和迁移，在缺血组织、角膜、脉络膜和虹膜的血管形成过程中发挥重要作用。本研究通过应用新型的神经再生小室模型观察到NGF在周围神经再生过程中具有较为明显的血管形成作用，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物手术与实验分组

　　选取健康成年清洁级SD大鼠36只，雌雄不拘，体重200～250 g，平均229 g(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所动物中心提供)。10 g/L戊巴比妥钠按30 mg/kg腹腔内注射麻醉。侧卧位，剃毛、消毒后，取股后斜切口，暴露右侧坐骨神经，10倍手术显微镜下游离坐骨神经，并在梨状肌出口下方5 mm处将坐骨神经切除约8 mm，任其回缩，造成10 mm缺损，用自行研制的梭形双通道乳胶管[1]桥接神经缺损段，用10-0无损伤显微缝合线将神经远、近断端与桥接管缝合固定2针。缝合方法采用两定点套接法：即分别在神经干周径180°两相对位置各缝合1针，使得再生神经断端套入桥接管内，并距2支管的分叉处约1 mm。根据梭形管2支管内加入的药物不同将动物随机分两组，每组每个时间点6只动物。A组：2支管内分别注入医用几丁糖凝胶100 μl(上海其胜生物制剂有限公司);B组：2支管内注入医用几丁糖凝胶100 μl后，再用微量注射器分别将5 μl NGF(20 ng/μl，美国Sigma公司)和5 μl睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)(60 ng/μl，美国Sigma公司)注入到2支管的中段，用0-0丝线将桥接管缝合固定在邻近的软组织上，逐层缝合肌膜和皮肤切口，在统一标准条件下分笼饲养。

　　1.2 术后观察与检测方法

　　1.2.1 一般观察 分别于术后4、8、16周将大鼠再次麻醉，沿原皮肤瘢痕切开皮肤及皮下组织，显露桥接管，观察梭形双通道乳胶管有无移位、变形、塌陷及裂开，并纵向剖开桥接管，观察梭形双通道乳胶管的2支管内再生神经的颜色、质地、弹性、粗细等。

　　1.2.2 组织病理学观察 于术后8、16周将大鼠麻醉后，剪开胸腔，左心室主动脉插管，剪开右心耳。快速灌入生理盐水150～200 ml，待流出液体清亮后，灌注40 g/L多聚甲醛约200 ml。固定2 h后取再生神经放入40 g/L多聚甲醛中继续固定。然后将标本常规脱水、透明、浸蜡、包埋后行石蜡切片，切片方法分为纵切和横切，片厚5 μm，HE染色，观察2支管内再生神经形态学特征和神经纤维束间和束内的血管分布情况。

　　1.2.3 超微结构观察 术后4、8周将动物麻醉、固定后，剪开胸腔、左心室插管，剪开右心耳。快速灌入生理盐水150～200 ml，待流出液体清亮后，灌注40 g/L多聚甲醛约200 ml。取2支管内再生神经的中段用4%戊二醛及1%四氧化锇(磷酸盐配制)作预固定和后固定(pH 7.2～7.4)各2 h，酒精及丙酮逐级脱水，采用环氧树脂618定向包埋，用ReichertJung超薄切片机作0.5 μm厚半薄切片，经1%甲苯胺蓝-天青Ⅱ染色后在光镜下定位，制备超薄切片，用醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，在Hitachi-600透射电镜下观察再生神经轴突形态及血管密度与分布。

　　2 结 果

　　2.1 一般观察

　　术后4周，桥接管周围为膜状组织所包绕，无裂口、变形、变薄、变色、移位和塌陷。剖开桥接管，管内两断端神经向前延伸，A组6只大鼠有2只可见再生神经断端呈吻合状，另4只仅呈芽状再生，且2支管内再生神经大体形态无显著性差异;B组6只大鼠CNTF侧神经再生成功有5只，另1只呈芽状再生;NGF侧神经再生成功仅2只，另4只呈芽状再生，但再生神经纤细，呈橘红色或粉红色，粗细欠均匀，质脆，CNTF侧再生神经呈淡黄色，粗细均匀，质韧，弹性好。至术后8周，桥接管无移位变形，剖开桥接管观察再生神经，A组桥接管内再生神经呈淡黄色，粗细、弹性均无明显差别，B组6只动物的CNTF侧再生神经均呈淡黄色，粗细均匀，质韧，弹性好，NGF侧再生神经4只呈粉红色，2只呈橘红色，表面欠光滑，粗细欠均匀、质脆、弹性差(图1)。至术后16周，桥接管无裂口、移位和塌陷，表面仍为膜状组织，肉眼可见新生血管稍较多。桥接管内再生神经均变粗，A组内再生神经呈淡黄色，粗细、弹性均无明显差别。B侧NGF侧再生纤维外观5只呈淡红色，1只呈橘红色，质嫩，弹性差，而CNTF侧再生神经均呈淡黄色，质韧、弹性佳。

　　2.2 HE染色

　　术后8、16周A组再生神经纤维排列欠整齐，炎性细胞及雪旺细胞较密集，但2支管内形态无显著性差异，B组NGF侧再生神经外膜较厚，纤维排列紊乱，炎性细胞及雪旺细胞密集，纤维束间和束内可见较多的新生血管，而CNTF侧再生纤维外膜薄，纤维排列整齐如波纹状，炎性细胞及雪旺细胞减少，束间和束内的新生血管较少(图2～4)。

　　2.3 超微结构观察

　　术后4 周，A组“再生神经”透射电镜观察未见再生轴突，仅为雪旺氏细胞(Schwann cells,SCs)、巨噬细胞及成纤维细胞。B组NGF侧见少量的有髓纤维散落在成纤维细胞之间，SCs和新生的血管较多见;而CNTF侧再生纤维为幼稚的新生纤维，呈巢状分布，未形成髓鞘，成纤维细胞及新生血管较少。术后8周，B组NGF侧有髓纤维的数量增加，但无髓纤维较少，成纤维细胞及新生血管仍多见，CNTF侧为较多的有髓与无髓纤维，成纤维细胞及新生血管均少见。(图5、6)。

　　3 讨 论

　　血管形成是生殖、胚胎发育、器官形成、伤口愈合和组织再生过程中的重要环节，其过程复杂，包括内皮细胞的增殖、迁移和分化，细胞外基质的降解，毛细血管出芽再生[2]。在血管形成的过程中有较多的血管生成因子参与，包括直接诱导因子和间接诱导因子，较常见的直接诱导因子有碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，血管内皮细胞生长因子(vessel endothelial growth factor，VEGF)，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等;而间接诱导因子包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)，转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)等[3]。研究表明血管内皮细胞不仅可产生和释放NGF，还可表达NGF的高亲和性受体TrkA和低亲和受体p75NGFR[4]，而且外源性的NGF可使脉络膜上的血管内皮细胞迁移增加约50%、增生增加约47%;既往研究发现NGF可促进缺血肌组织、脑组织及新生大鼠颈上神经节的血管形成[5],但能否促进损伤的周围神经血管形成尚未见报道。

　　图1 术后8周，B组再生神经大体观察：NGF侧再生神经呈粉红色，表面欠光滑，粗细欠均匀，质脆，弹性差(↑);CNTF侧再生神经均呈淡黄色，粗细均匀，质韧，弹性好 图2 术后8周，B组NGF侧再生神经横切面(HE×400)：再生神经束间及束内有较多的新生血管(↑) 图3 术后8周，B组CNTF侧再生神经(HE×200)：外膜薄，纤维排列整齐，束间和束内的新生血管较少 图4 术后8周，B组NGF侧再生神经纵切面(HE×200)：外膜较厚，纤维排列紊乱，束间和束内可见明显的新生血管(↑) 图5 术后8周，B组CNTF侧再生神经超微结构(×3 000)：有髓与无髓纤维较多，但新生血管少见(↑) 图6 术后8周，B组NGF侧再生神经超微结构(×3 000)：有髓纤维较少，且可见较多的新生血管

　　本研究利用新型的神经再生小室[1]，通过在再生小室的2支管内分别加入NGF和CNTF，不仅比较了NGF、CNTF对大鼠同一坐骨神经再生的促进作用，而且还观察到NGF在周围神经再生过程中具有较为明显的血管形成作用。术后4周，神经再生的早期，NGF侧再生神经呈橘红色或粉红色，粗细欠均匀，质脆，超微结构也证实，再生神经内新生的血管较对照CNTF侧明显丰富。术后8、16周神经再生的中、晚期，NGF侧再生神经外观呈粉红色或淡红色，表面欠光滑，粗细欠均匀，质脆，弹性差，HE染色显示：虽然NGF侧再生神经较CNTF侧再生神经纤维排列紊乱，粗细不均，但纤维的束间和束内具有较丰富的毛细血管。超微结构也观察到NGF侧再生神经为少量的有髓纤维和较多的成纤维细胞及新生血管，从而在形态学上证实了NGF在周围神经再生的早、中、晚期均显示了促进血管形成的作用。此外，本研究还观察到虽然NGF促进血管形成的作用较对照CNTF强，但其促进神经再生的作用不及CNTF，表明NGF促进血管形成的作用与促进神经再生的作用可能是相互独立的，与既往研究将NGF称之为直接血管形成因子的结论相一致[2]。

　　关于NGF促进血管形成的机制，既往研究认为主要通过促进血管内皮细胞的迁移和增殖实现的，其促进血管内皮细胞增殖的信号转导机制可能涉及到SrcPI3KAkt传导通路。外源性的NGF首先使靶器官细胞膜上的TrkA受体磷酸化，从而诱导细胞有丝分裂原蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK),Akt,和 Src磷酸化。使Src，PI3K.和Akt活化，进而激活蛋白激酶G，该作用可被PP2、LY294002、 AktI、 KT5823和PD98059等阻断剂所阻断。然而，NGF促进内皮细胞的迁移并不涉及MAPK 和 Src信号转导通路，而是通过PI3KAktMMP途径实现的，NGF通过与TrkA受体结合，使PI3K(phosphatidylinositol3kinase)磷酸化，在脉络膜血管内皮细胞，PI3K磷酸化又导致Akt的活化，使MMP9 (matrix metalloproteinase9)和 MMP2的转录活性增强[6]。而MMP9和MMP2的生物活性主要是降解脉络膜，充许内皮细胞通过脉络膜孔隙，完成迁移。在神经系统，NGF主要显示保护神经元，促进轴突再生的作用，其促进周围神经血管形成的作用少见报道。本实验通过大体观察、HE染色和透射电镜均证实了NGF在周围神经损伤再生中具有较为明显的促进血管形成作用，且其血管形成作用贯穿于神经再生早、中、晚期，其作用机制可能与成纤维母细胞的增殖密切相关，因为周围神经再生的过程中，NGF的血管形成作用与大量的成纤维母细胞增殖相一致，而成纤维母细胞又是多种直接和间接血管形成因子的来源，因此，NGF可能正是通过促进成纤维母细胞的增殖，分泌多种血管形成因子而促进血管形成的，但该观点尚需进一步研究证实。

【参考文献】
  　　[1] 李 强,刘 媛,伍亚民，等.NGF与CNTF促进周围神经轴浆运输功能恢复的比较研究[J].中国矫形外科杂志,2005,5:358-361.

　　[2] 李 强,张玉波,伍亚民.神经生长因子促进血管形成的研究进展[J].国外医学外科学分册，2006，3:220-223.

　　[3] Lad SP,Peterson DA,Bradshaw RA,et al.Individual and combined effects of TrkA and p75NTR nerve growth factor (NGF) receptors:a role for the high affnity receptor site[J].J Biol Chem,2003,278:24808-24817.

　　[4] Emanueli C,Salis MB,Pinna A,et al.Nerve growth factor promotes angiogenesis and arteriogenesis in ischemic hindlimbs[J].Circulation,2002,17:2257-2262.

　　[5] Calza CL,Giardino L,Giuliani A,et al.Nerve growth factor control of neuronal expression of angiogenetic and vasoactive factors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:4160-4165.

　　[6] Nusser N,Gosmanova E,Zheng Y,et al.Nerve growth factor signals through TrkA,phosphatidylinositol 3kinase,and Racl to inactivate RhoA during the initiation of neuronal differentiation of PC12 cells[J].J Biol　 Chem，2002,39:35840-35846.

作者单位：1.解放军第98医院全军创伤骨科中心,浙江 湖州 313000; 2.第三军医大学野战外科研究所，重庆