组织工程骨神经化构建的组织学研究

【摘要】  [目的]通过观察不同神经束植入组织工程骨后组织学的变化，探讨组织工程骨神经化构建的效果。[方法]将新西兰大白兔的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs )进行诱导分化为成骨细胞，与β磷酸三钙(βtricalcium phosphate，βTCP)复合制作组织工程骨，分别将不同类型神经束植入组织工程骨，进行以下分组：A组，组织工程骨组; B组，感觉神经束植入组; C组，运动神经束植入组; D组，血管束(含有自主神经)植入组; E组，感觉、运动神经束联合植入组。分别用于修复兔股骨1.5 cm大段骨缺损;各组分别在12周进行组织学的Masson染色，降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide,CGRP)的免疫组织化学检测，并进行统计学分析，以比较骨缺损修复情况。[结果]在观察期内，有感觉神经植入的组别和血管束植入的组别在组织学上具有明显骨化作用，而运动神经束植入却没有明显的促进作用。[结论]感觉神经束和血管束具有明显的促组织工程骨成骨作用，可以作为组织工程骨神经化构建的一种方法。

【关键词】  组织工程骨; 神经化; 骨缺损

Histology research about nervalization of tissue engineered bones∥LIU Yong,PEI Guoxian,JIANG Shan,et al.The Traumatic Centre of 89th Hospital of PLA,Wei Fang,261021，China

　　Abstract：To study the ossification effect by histology research on tissue engineered bone by transplanting nerval bundles of different types.The Newzeland rabbit BMSCs (bone marrow stromal cells，BMSCs) were induced to osteoblast and compounded with βTCP (βtricalcium phosphate，βTCP)to make tissue engineered bones,and different kinds of nerval bundles were transplanted into these tissue engineered bone.All Newzeland rabbits were divided into 5 groups according to different types of nerval bundles:Group A,tissue engineered bones without nerval bundles transplantation.Group B,tissue engineered bones transplanted with sensory nerval bundles.Group C,tissue engineered bones transplantation with motor nerval bundles.Group D,tissue engineered bones transplanted with vascular bundles (autonomic nerves contained).Group E,tissue engineered bones transplantation with both sensory and motor nerval bundles.Then,1.5 cm bone defect in femur of Newzeland rabbits were repaired.At 12 week,gross specimen observation,histology studies and immunohistochemistry were used to compare the results of bone repair in different groups.During the observation period,tissue engineered bones transplanted with sensory and vascular bundles effectively accelerated the ossification of the tissue engineered bones,while those transplanted with motor nerval bundles did not.Sensory nerval bundles and vascular bundles can effectively accelerate the ossification of tissue engineered bones.They can be used as a construction method for nervalization after tissue engineered bone.

　　Key words：tissue engineered bone; nervalization; bone defect

　在组织工程学领域，组织器官的构建最终目的是获得一个有功能的组织和器官。这样，构建的组织、器官的血管、神经化成为其在体内存活和发挥功能的关键因素。神经在正常骨组织中的分布及在骨组织代谢等方面的研究表明神经因素对骨的发育、修复、改建等有显著作用。为探索组织工程骨神经化构建的方法，设想利用显微外科技术，将感觉神经、运动神经和血管束(包含与血管伴行的自主神经)分别植入大段组织工程骨，并用以修复兔股骨大段骨缺损来分别验证不同种类神经在构建大段组织工程骨的作用，为进一步深入研究和走向临床探讨一种构建组织工程骨神经化的方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 健康新西兰大白兔30只(由南方医科大学南方医院动物所提供),6个月龄，雌雄不限，体重2～3 kg。

　　1.1.2 材料与试剂 多孔βTCP(圆柱状，直径8 mm，长15 mm，中间有侧槽,由法国贝奥路公司提供)，四孔普通钢板(长6.5 cm，螺钉3.5 mmф)， 电钻，线锯，手术包，胎牛血清(Hyclone)，DMEM培养基、胰蛋白酶、抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠均购自Sigma公司，多克隆羊抗兔CGRP抗体、及过氧化物酶标记的兔抗羊IgG均购自Chemican公司，SABC试剂盒购自武汉博士德公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 实验动物分组 随机分为5组，每组6只动物。A组：组织工程骨组; B组：感觉神经束植入组; C组：运动神经束植入组; D组：血管束(含有自主神经)植入组; E组：感觉、运动神经束联合植入组。

　　1.2.2 组织工程骨的制备方法 成年新西兰大白兔30只(在培养过程中因各种原因死亡的动物如数补足)，采用速眠新、氯胺酮和阿托品复合液肌肉注射麻醉。细胞的获取、培养、诱导及与βTCP材料的复合参考文献[1],制作组织工程骨备用。

　　1.2.3 兔股骨15 mm骨缺损模型的制备方法 作者先前的研究显示兔股骨15 mm缺损自身不能修复，是理想的负重骨缺损的动物模型[2]。于兔右侧后肢股骨前外侧做一纵形切口，长约8 cm,切开皮肤、皮下组织和深筋膜，沿股直肌与股内侧肌间隙锐性分开，显露股骨。不切开骨膜,于股骨前外侧放置已塑形(钢板预弯一定的弧度，约5°～8°，以使钢板和股骨向前外凸的弧度相吻合)好的4孔普通钢板，电钻钻孔后依次旋入4枚螺钉固定，并在两边两个螺钉之间各加用一根细钢丝环扎固定。于钢板第2、3孔之间，以线锯锯断股骨一侧，用直尺测量股骨1.5 cm长,并标记好另一端截骨线，线锯锯断，并切除该段对应的骨膜，造成1.5 cm段骨缺损与骨膜缺损。于骨缺损处嵌入复合细胞的βTCP，并用丝线与钢板固定。然后分别进行以下操作制作5组实验动物模型： A组，在股骨内侧切口，直到股骨处，以增加对照的同一性。B组，在股骨内侧切口，寻找并将感觉神经(隐神经)游离足够的长度，锐性切断，将隐神经束末端用显微剪刀分成爪状植入βTCP材料复合物的侧槽内，用丝线于神经外膜上缝一针固定于周围组织。C组，在股骨根解剖出由股神经发出的支配股内侧肌的肌支，游离一段长度，锐性切断，末端用显微剪刀分成爪状植入βTCP材料复合物的侧槽内，用丝线于神经外膜上缝一针固定于周围组织。D组，在股骨内侧切口，解剖游离股血管束，游离所需长度后不切断血管，直接将血管束顺行植入βTCP材料复合物的侧槽内。E组，在股骨内侧切口，解剖游离隐神经、运动神经，并锐性切断，末端用显微剪刀分成爪状植入βTCP材料复合物的侧槽内，用丝线于神经外膜上缝一针固定于周围组织。术毕，各组按层缝合切口，包扎。术后青霉素钠40万μ肌注,每日2次，共3 d预防感染。

　　1.3 检测方法

　　1.3.1 组织学观察 在术后12周时取材标本制成切片，进行Masson三色染色，对比观察材料降解、成骨和血管化情况。并用图像分析软件测定新生骨组织在骨缺损区域所占面积。

　　1.3.2 免疫组织化学染色 在术后12周时取材标本制成切片，进行CGRP的免疫组织化学染色。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据用SPSS 13.0软件处理。数据用± s表示。数据差异用完全随机设计的多样本均数比较的方差分析。检验水准：α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 一般情况

　　术后第1 d所有兔的精神状况稍差，进食略减少，活动减少，术肢跛行明显。全身无皮疹及畏寒发热，无血尿。2 d后逐渐恢复正常活动，饮食增加，精神好转。所有实验动物无死亡，有1只术后发生感染，被剔除实验，并补充。

　　2.2 大体观察

　　术后12周取材，见各组的骨缺损均有不同程度的修复，其中，A、C组修复情况最差，骨缺损还未完全修复，骨痂还未完全成熟，骨缺损周围见大量的纤维结缔组织;而B、D、E组已完全修复骨缺损，形成大量的皮质骨结构。

　　2.3 组织学观察

　　2.3.1 12周时对各组标本进行Masson染色，见各组均有不同程度的骨化现象和βTCP材料的降解。A、C组仍可见大量和大块的βTCP材料未降解，材料周围的骨化程度较低;B、D、E组可见未降解βTCP材料被骨组织分割包围成较小的颗粒，其骨化程度均较A、C组为优(图1)。对新生骨组织在骨缺损区域所占面积进行统计学分析显示了同样的结果(表1)。在各组形成的骨痂处取材，组织学染色(Masson)可见A、C组骨痂成熟度较低，还未见明显骨板结构，骨细胞排列无序散乱;而B、D、E组可见较为明显的骨板样结构，骨细胞趋向有序排列，显示了较高的骨痂成熟度(图2)。

　　2.3.2 12周时对各组标本进行CGRP的免疫组织化学染色，见B、D、E组均有强阳性表达，而在A、C组表达较弱(图3)。

　　表1 各组骨缺损处新生骨所占面积(n=6 ±s)分组ABCDE新生骨所占面积(%)0.4028±0.03050.6168±0.03180.4104±0.0322 0.6362±0.03290.6253±0.0344

　　注： A、C组比较无显著性差异(P>0.05);B、D、E组相互间比较无显著性差异(P>0.05);B、D、E组与A、B两组相比均

　　有显著性差异(P<0.05)，且均优于A、B两组。

　　图1 5组术后12周标本组织学观察 A(图1a)组和C(图1c)组仍可见大块的材料未降解，材料周围的骨化程度较低;B(图1b)组、D(图1d)组和E(图1e)组可见未降解材料被骨组织分割包围成较小的颗粒，其骨化程度均较高(Masson ×100) 图2 5组术后12周骨痂组织学观察：A(图2a)组和C(图2c)骨痂成熟度较低，还未见明显骨板结构，骨细胞排列无序散乱;而B(图2b)、D(图2d)组和E(图2e)组可见较为明显的骨板样结构，骨细胞趋向有序排列，显示了较高的骨痂成熟度(Masson ×200) 图3 5组术后12周CGRP免疫组织化学观察：B、D、E组(图3a)CGRP呈强阳性表达，A、C组CGRP(图3b)表达较弱，散在分布。

　　3 讨 论

　　人们对骨组织的神经支配问题曾经一度有过模糊的认识,随着解剖学的发展，才通过解剖发现骨组织中存在着神经纤维并通过组织学的方法加以确认。神经系统对于其靶器官具有营养和调控作用，对于骨组织也是如此。神经性病变往往引起支配区的骨萎缩，神经末梢分泌的各种神经肽类和神经生长因子在骨的改建过程中发挥了重要的作用。目前，已知的与骨组织相关的神经因子和神经肽主要有：神经生长因子(nerve growth factor,NGF)，降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide,CGRP)，神经肽Y(neusopeptide Y,NPY),P物质(surface active substance，SP)，血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)等。其中含SP、CGRP的肽能神经来源于感觉神经，含VIP、NPY的肽能神经来源于自主神经。这些肽能神经可通过神经末梢释放相应的神经肽，作用于靶细胞来影响骨组织的代谢。CGRP能促进成骨细胞中环磷酸腺苷(c-AMP)形成，从而提高成骨活性，并可刺激骨髓干细胞有丝分裂和骨基质细胞的分化参与成骨细胞的信息传递[3、4]，显著抑制骨的吸收，提高骨的密度在骨形成过程中起到了“催化剂”的作用[5]。有研究表明CGRP还具有刺激血管内皮细胞增生的作用,从而可促进骨的血管化[6]。以往的研究表明,SP可通过刺激骨髓干细胞有丝分裂增加骨集落数目，并通过刺激骨细胞分化和成骨细胞活性引起骨集落尺寸增加。现已发现破骨细胞上有SP的受体,SP可直接作用于破骨细胞,增加破骨细胞的活性,促进骨的吸收。可见SP对于骨的改建和塑型意义重大。VIP神经来自交感神经,在成骨细胞和破骨细胞上都有VIP的受体,可以提高成骨细胞的活性并具有强烈的扩血管作用,调节局部的血流量进而促进骨的生成，VIP纤维绝大部分分布于骨膜，以旁分泌方式作用于成骨细胞和破骨细胞,调节骨的代谢。NPY是强有力的血管收缩剂,在骨组织中主要功能是血管调节从而影响骨的血流量，并能够促进血管生成,另外成骨细胞表达NPY 受体mRNA，表明NPY可以通过与受体结合来调节成骨细胞功能。

　　实验研究证明外周神经纤维可以再生，临床上神经的断端吻合可以不同程度的恢复神经的功能。近年来，国内外多有报道将感觉神经植入皮瓣中可以恢复皮瓣的感觉功能，将运动神经埋植入失神经支配的肌肉中可以恢复其运动功能。这给我们将神经植入组织工程骨以期建立神经支配提供了很好的借鉴意义。

　　神经可通过神经末梢释放相应的神经肽，作用于靶细胞来影响骨细胞的代谢。切断的神经束植入组织工程骨后，神经束近断端通过未损伤或未潰变的神经元，以及侧芽发生及中枢内自身调节等多种因素起作用，以后随着轴突再生，轴浆流恢复，新生神经与靶器官结合参与骨的生长代谢。临床上可见周围神经损伤后可以过度刺激成骨，神经切断可能也会对局部的骨组织起促进作用。在实验中发现感觉神经的促成骨作用明显优于运动神经，这可能与两种神经内所含有的肽类物质的种类与数量有关，需要进一步的实验来验证。

　　现已表明，神经系统对骨形成的影响是复杂的。在大鼠的不同部位造成神经损伤，通过在骨骼肌中植入冻干皮质骨，比较异位成骨情况。结果发现，颅脑损伤组表现成骨加速，脊髓损伤组则表现为成骨延迟，周围神经损伤组也表现为成骨加速。感觉神经束植入组织工程骨后，神经束近断端通过未损伤或未潰变的神经元，以出芽方式生长，新生神经纤维与靶器官结合，通过轴浆运输神经肽类物质，参与骨的生长代谢。另外，从12周的组织学染色上可以看到感觉神经植入的组织工程骨内可见多量的血管，分析可能是感觉神经分泌的神经肽类物质加速了血管的生成，促进了血管化，从而加速了骨的修复。

　　从组织学上来看，有感觉神经和血管束植入的组别，在12周时，其骨痂中骨细胞的排列已趋于有序，接近正常骨。而没有神经植入或单纯运动神经植入的组别，其骨细胞的排列仍然无序。这一点也支持了感觉神经和自主神经对成骨质量的巨大影响。同时，免疫组织化学显示CGRP在B、D、E组强阳性表达，这可能与CGRP在不同种类的神经纤维中含量不同所致。

　　本实验研究初步观察了神经束植入的方法对组织工程骨骨化的影响,认为感觉神经植入的方法对组织工程骨的成骨和改建具有重要的促进作用。感觉神经与运动神经所含成分的不同及其作用、植入神经在组织工程骨内的生长与分布及与骨组织细胞的靶向关系、神经植入组织工程骨成骨效果的远期评价等也需要进一步的研究，以便更好的认识神经因素在组织工程骨构建中的规律。

【参考文献】
  　　[1] 张元平,金 丹,裴国献,等.神经化组织工程骨构建的初步观察[J].中华创伤骨科杂志,2005，7：60-65.

　　[2] 王永刚，裴国献，张洪涛，等.兔股骨干缺损模型的制备及在组织工程骨实验中的应用[J].中华创伤骨科杂志，2005，7：971-974.

　　[3] Ballica R,Ualentijn K,Khachatryan A,et al.Targeted expression of calcitonin generelated peptide to osteoblasts increases bone density in mice[J].J Bone Miner Res,1999,14:1067-1074.

　　[4] Douglas MB,StehnoBittel L,et al.Calcitonin generelated peptide elevates calcium and polarizes membrane potential in MG-63 cells by both cAMPindependent and dependent mechanisms[J].Am J Physiol Cell Physiol，2004,287:457-467.

　　[5] Ishizuka K,Hirukawa K,Nakamura,et al.Inhibitory effect of CGRP on osteoclast formation by mouse bone marrow cells treated with isoproterenol[J].Eurosci Lett,2005,29:47-51.

　　[6] Lundgaar A，Aalkjaer C，Bjurholm A，et al.Vasorelaxation in isolated bone arteries,vasoactive intestinal polypeptide,substance P,calcitonin gene related polypeptide,and bradykinln studied in pigs[J].Acta Orthop Scand,1997,68：481-489.

作者单位：1.解放军第89医院全军创伤骨科研究所,山东 潍坊 261021;2.南方医科大学南方医院创伤骨科,广州 510515