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【摘要】 ［目的］研究降钙素（calcitonin, CT）对骨性关节炎关节软骨退变和软骨下骨骨代谢的影响。［方法］30只3个月龄雌性日本大耳白兔随机分为三组，其中两组行右膝关节前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transaction，ACLT)，分为ACLT+CT组和ACLT+NS组，第3组为Sham组。ACLT+CT给予每日1次皮下注射降钙素5 IU/(kg·d)，持续8周，ACLT+NS组给予同样剂量生理盐水。术后8周后处死所有动物。取股骨髁制成切片行MMP-13和Ⅱ型胶原免疫组化染色。取胫骨近端制成硬组织切片行骨形态计量学检测。体外实验中，取兔膝关节软骨，经消化、培养，将第3代软骨细胞分三组：向IL-1β组加入人重组IL-1β(10 ng/ml)。 IL-1β+CT组加入人重组IL-1β (10 ng/ml)2 d后，再向培养液中加入CT(50 ng/ml)。正常组不加任何诱导剂和干扰剂培养。然后行MMP-13、Ⅱ型胶原免疫组化检测和Realtime RT-PCR法检测。［结果］Sham组和ACLT+CT组软骨下骨骨小梁相对体积和厚度等均显著高于ACLT+NS组。Sham组和ACLT+CT组的Ⅱ型胶原的光密度值均显著高于ACLT+NS组，而MMP-13的光密度值显著低于ACLT+NS组（P<0.05）。正常组和IL-1β+CT组的Ⅱ型胶原光密度值均显著高于IL-1β组而MMP-13的光密度值都显著低于IL-1β组（P<0.05）。在正常组和IL-1β+CT组中Ⅱ型胶原的mRNA含量均显著高于IL-1β组而MMP-13的mRNA含量均显著低于IL-1β组（P<0.05）。［结论］降钙素5 IU/(kg·d)皮下注射能够增加ACLT兔膝关节软骨Ⅱ型胶原的分泌和抑制MMP-13的表达，并可能通过调节软骨下骨的骨代谢和微结构来保护关节软骨； CT（50 ng/ml）能增加体外培养的含有IL-1β（10 ng/ml）的软骨细胞中Ⅱ型胶原的含量和抑制MMP-13分泌。
【关键词】 降钙素 骨性关节炎 关节软骨 软骨下骨
Effects of calcitonin on articular cartilage degeneration and subchondral bone metabolism of osteoarthritic rabbit knee in vivo and in vitro
LI Bin, ZHANG Liu, HU Hong-yu, et al.
Department of Orthopaedic Surgery, North China Coal Medical College, Tangshan Hebei 063000, China
Abstract: ［Objective］To access whether calcitonin （CT） exerts a protective action on the articular cartilage and subchondral bone of rabbit knees. ［Methods］Thirty 3- months Japanese white rabbits were divided randomly into three groups.The first two groups received anterior cruciate ligament transaction (ACLT) on the right knee (ACLT+CT group and ACLT+NS group).The third group was sham group. ACLT+CT group received a subcutaneous injection of salmon calcitonin 5IU/ (kg/d) for 8 weeks.ACLT+NS group received NS at the same dose. All rabbits were sacrificed at 8 weeks postoperativey. The samples were stained immunohistochemically for collagen type II and MMP-13 and stained for the bone histomorphometric measuring. In vitro, the chondrocytes from articular surface were cultured and divided into 3 groups at passage 3:IL-1β group, cells were cultured in 10% DMEM containing 10ng/ml IL-1β; IL-1β+CT group, cells were cultured in 10% DMEM containing 10ng/ml IL-1β for 2 days, and the cultures were then exposed to medium containing 50ng/ml salmon calcitonin;and the normal group, cells were cultured in 10% DMEM . The cells was stained immunohistochemically for collagen type II and MMP-13, and mRNA expressions of collagen type II and MMP-13 were examined by realtime RT-PCR.［Results］Compared with the ACLT+NS group, the rabbits in sham group and ACLT +CT treated group markedly increased the trabecular bone relative volume (BV/TV) and trabecular bone thickness (Tb.Th). Immunohistochemistry staining showed the integrated optical density(IOD) of type II collagen in ACLT+ NS group was markedly lower than that of ACLT+ CT group and sham group（P<0.05）.However the IOD of MMP-13 in ACLT+NS group was higher（P<0.05）. The IOD of type II collagen in normal group and IL-1β+CT group were higher than that of IL-1β group, but that of MMP-13 in IL-1β group was higher（P<0.05）. The IL-1β+CT group and the normal group expressed significantly higher type II collagen mRNA than that in the IL-1β group.The normal group and the IL-1β+CT group expressed lower MMP-13 mRNA than that in IL-1β group markedly.［Conclusion］Subcutaneous injection of calcitonin 5 IU/(kg/d) probably protects cartilage of ACLT rabbit knee by increasing the expression levels of type II collagen,decreasing the expression levels of MMP-13,modulating subchondral bone metablism and improving microarchitechture of subchondral bone.In vitro CT（50ng/ml）can incease the expression of type II collagen and inhibit the expression of MMP-13 in chondrocyte culture containing 10ng/ml IL-1β.
Key words：calcitonin; osteoarthritis; articular cartilage; subchondral bone
骨性关节炎（osteoarthritis, OA）是最常见的关节疾患之一，表现为关节软骨进行性退变，软骨下骨传导应力负荷失常，最终发生软骨变薄、纤维化、糜烂、裂隙、肉眼下溃疡及全层关节面消失等。目前有报道认为基质金属蛋白酶（matrix metallpronase, MMPs）在骨性关节炎当中起着重要作用，由于MMPs对软骨基质的降解，导致软骨的退变、减少、破坏［1］。以往对OA的病因研究多集中于关节软骨的破坏，近期一些研究［2、3］提示：软骨下骨硬化与OA的发生、发展密切相关。降钙素（calcitonin, CT）是一种公认的抗骨再吸收剂［4］，近年来有研究发现降钙素对兔关节软骨有保护作用从而具有治疗骨性关节炎的潜在作用［5］，但具体机制以及CT对软骨下骨的骨代谢的作用机制还未明确。本实验采用前交叉韧带切断术诱导兔膝关节炎，用体内试验结合体外实验的方法通过研究MMP-13和Ⅱ型胶原在软骨中的表达来检测软骨下骨骨组织形态，探讨CT对骨性关节炎关节软骨及软骨下骨的影响及其作用机制，进而为临床应用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 体内试验
1.1.1 动物分组和给药方法
健康3个月龄雌性日本大耳白兔30只（购自北京维通利华公司，批号：SCXK京，2007-0001）。随机分为三组：对照组（Sham）、盐水组(ACLT+NS)和降钙素组(ACLT+CT)。ACLT+NS和ACLT+CT行右膝关节前交叉韧带切断术。造模术后，ACLT+CT给予每日1次皮下注射降钙素（瑞士诺华制药北京公司）5IU/kg，持续8周，ACLT+NS组给予同样剂量生理盐水皮下注射。Sham组只打开右膝关节，不行前交叉韧带切断术,缝合膝关节。所有实验动物在处死前10天和3 d分别皮下注射盐酸四环素和钙黄绿素行荧光双标记。
1.1.2 标本采集和处理
8周后处死动物，立即解剖膝关节，肉眼和光镜下行股骨髁关节软骨退变的大体观察。将胫骨近端固定于70%酒精，冠状面锯开胫骨，脱水固定，经甲基丙烯酸甲脂包埋，作5 μm切片，每个标本切2张，其中1张薄片用于Gemisa染色，另1张用于测量荧光指标，无需染色。Giemsa染色，采用骨组织形态计量学方法测量软骨下骨骨小梁。股骨远端测量骨密度，股骨髁置于4%多聚甲醛中固定，15%EDTA-2Na溶液脱钙，石蜡包埋，作4 μｍ连续切片。行HE染色、MMP-13和Ⅱ型胶原免疫组化染色。
1.2 体外实验
1.2.1 兔膝关节软骨细胞的原代细胞培养
选取健康3个月龄日本大耳白兔5只脱颈处死，将股骨远端及胫骨近端软骨剪碎用0.2％Ⅱ型胶原酶消化，然后以105密度接种于25 cm2 培养瓶，放于37℃ CO2培养箱培养。每2 d换液1次。
1.2.2 传代细胞培养及给药分组
原代细胞培养融汇成致密单层增殖至瓶底，用0.25%胰蛋白酶消化液消化细胞2 min，镜下观察细胞变形并有部分脱离瓶壁后立即加入完全培养基终止消化，接种于培养瓶，2～3 d全量换液。传至第2代时，用10%血清培养液DMEM将处于对数生长期第3代软骨细胞，以1×104/ml 密度接种到放有盖玻片的2个24孔培养板内，每个24孔板分三组：向IL-1β组8个孔中加入人重组IL-1β（10 ng/ml）,保持5 d，隔2 d换液及细胞因子。向IL-1β+CT组8个孔中加入人重组IL-1β（10 ng/ml）保持2 d后，再向培养液中加入CT（50 ng/ml），再保持 2d。正常组8个孔不加任何诱导剂和干扰剂培养5 d作为正常组。5 d后将一个24孔板的软骨细胞进行MMP-13和Ⅱ型胶原免疫组化检测。另一个用于提取mRNA，Realtime-PCR法检测MMP-13和Ⅱ型胶原的表达。
1.3 免疫组织化学
4 μｍ连续切片，脱蜡至水。3%过氧化氢冲洗10 min，PBS冲洗3次×5 min，复合酶37℃修复10 min。 滴加抗兔BMP-2，MMP-13多克隆一抗抗体（购自武汉博士德）和Ⅱ型胶原（北京博奥森），4℃湿盒孵育12 h。余下步骤按照兔二步法检测试剂盒（购于北京中杉金桥）说明操作，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。
细胞爬片标本在多聚甲醛中固定40 min， PBS液冲洗3次×5 min后滴加3%H2O2 室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，除去PBS后滴加50 μl 0.1%TritonX-100室温下孵育15 min。PBS冲洗3次×5 min。除去PBS后滴加50 μl 5%的封闭液室温下孵育20 min，PBS冲洗3次×5 min。余下步骤同上。
1.4 Realtime RT-PCR
采用Trizol一步法提取软骨细胞总RNA，RNA定量后反转录合成第1链cDNA反应总体积为20 μl，2 μg RNA+ Oligo(dT) 18 primer(0.5 ug/μl) 1.0 μl , 加去DEPC水至12 μl。混合均匀后离心3～5 s。 然后将混合液放在70℃环境中孵育5 min，在冰上冷却30 s，随后离心收集混合液。加入5×reaction buffer 4 μl、RNase inhibitor(20 U/μl) 1.0 μl、dNTP mix (10 mmol/L) 2 μl，混匀，然后在37℃环境中孵育5 min， 结束后加入M-MuLV逆转录酶(20 U/μl) 1.0 μl，在37℃环境中孵育60 min，70℃加热10 min停止反应。PCR反应体系：总体积50 μl，包括：Reahime PCR MasterMix 25 Ixl，引物(10 I～mol／L)各2 ，cDNA模版5 I xl。PCR反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 S，60 ℃ 1 min， 40个循环。引物序列见表1。表1 引物序列cDNAPrimer sequenceGenBank accessionCOLII5′ (略)
1.5 观察指标
HE染色观察采用Mankin法评分，Ⅱ型胶原和MMP-13免疫细胞化学和免疫组织化学切片用CELL 1000病理图像采集系统进行图像采集，然后用Image Pro Plus（IPP）6.0软件对图像进行定量分析，分别于10倍物镜下取软骨表层至钙化层为观察范围，每个标本随机选3个视野测定光密度值(integrated optical density， IOD)并以其平均光密度均值作为测定结果。骨密度测量并记录三组标本股骨远端1/3骨密度和内（r1）外(r2)侧髁软骨下骨（软骨下0.2～0.6 cm间）的骨密度。Giemsa染色切片用Leica DMLB2荧光/光学显微镜及Leica DC 300数码摄像系统进行观察与摄取图像；在10倍物镜下取软骨下骨板至骨骺上骨板间骨小梁为观察范围，每个切片随机选3个视野，测定骨组织形态计量学相关指标参数。定量分析Reahime RT-PCR结果。
1.6 统计学分析
实验数据建立Excel数据库，采用SPSS 13统计软件进行单因素方差分析，实验数据以均值±标准差(x-±s)表示，以P＜0.05表示具有统计学意义。
2 结果
2.1 肉眼大体观察结果
由于膝关节前交叉韧带被切断，关节结构不稳定造成关节炎病理改变，软骨关节面破溃，并形成骨赘，以代偿关节的不稳定。Sham组，膝关节面光滑完整，有光泽，关节软骨状态均一；ACLT+NS组膝关节面完整性遭到破坏，呈现颗粒感，表面晦涩、无光泽，滑液混浊，股骨内侧髁边缘有骨赘，并且内侧髁关节软骨表面结构紊乱有虫蚀状溃疡； ACLT+CT组膝关节面偶见溃疡，较光滑完整，有光泽（图1）。
2.2 HE染色细胞形态学观察结果
HE染色显示：Sham组正常软骨着色均匀，软骨细胞核呈深蓝色，细胞层次清楚，排列整齐，大小均一，胞浆呈粉红色。ACLT+NS组关节软骨表层可见软骨细胞克隆增殖呈巢状及克隆周围大量软骨细胞消失， 细胞排列紊乱，软骨内细胞密度不均一，部分区域细胞密度增加或减少。ACLT+CT组软骨基质着色较为均匀，软骨细胞分层比之ACLT+NS组清晰有序，细胞形态也较规则，细胞克隆现象偶见（图2）。
ACLT+NS组Mankin 评分结果明显高于Sham组,表明本实验OA动物模型建立成功；ACLT+CT组与ACLT+NS组比较，Mankin 评分结果明显降低,有统计学意义（P<0.05）（表2）。表2 Mankin 评分结果GroupSham (n=10)ACLT+NS (略)
2.3 MMP-13和Ⅱ型胶原免疫组化染色结果
2.3.1 组织切片
MMP-13：关节软骨阳性细胞的胞质和胞外基质染成棕黄色。Sham组胞质和基质着色区域少，着色浅；ACLT+NS组胞质和胞外基质着色区域广泛，着色深；ACLT+CT组胞质和胞外基质着色范围较少，局限于软骨表层，阳性细胞较少且着色较浅（图3）。
Ⅱ型胶原：关节软骨阳性细胞的胞质和胞外基质染成棕黄色。Sham组胞质和基质着色区域很广泛，着色很深；ACLT+NS组胞质和胞外基质着色范围很少，且着色很浅；ACLT+CT组胞质和胞外基质着色区域较广泛，着色较深（图4）。
2.3.2 细胞爬片
MMP-13：兔软骨阳性细胞的胞质染成棕黄色。正常组胞质着色很浅，IL-1β组胞质着色很深，IL-1β+CT组则着色较浅（图5）。
Ⅱ型胶原：兔软骨阳性细胞的胞质染成棕黄色。正常组胞质着色很深，IL-1β组着色很浅，IL-1β+CT组着色较深（图6）。
阳性细胞平均光密度值（IOD）能反映细胞内阳性蛋白的强度。染色愈深，光密度值愈大，即光密度值与阳性蛋白的强度呈正比（表3、4）。
表4 软骨细胞Ⅱ型胶原和MMP-13免疫组化光密度值Group正常组 (略)
根据以上细胞Ⅱ型胶原免疫组化结果和细胞形态学观察亦可鉴定培养的细胞为软骨细胞。
2.4 骨密度测量结果
ACLT＋CT组与Sham组的股骨内侧髁软骨下骨骨密度均显著高于ACLT+NS组（P<0.05）；ACLT＋CT组股骨远端1/4骨密度显著高于ACLT+NS组（P<0.05）（表5）。表5 骨密度测量结果GroupSham (略)
2.5 骨组织形态计量学测量结果
ACLT+CT组、Sham与ACLT+NS组相比，骨小梁相对体积（BV/TV）、厚度（Tb.Th）、数量（Tb,N）均显著提高，而骨小梁分离度（Tb,Sp）都显著下降（P〈0.05）（表6）。表6 骨组织形态计量学测量结果GroupSham (略)
2.6 Realtime RT-PCR结果
通过PCR法检测，在IL-1β+CT组和正常组中Ⅱ型胶原的mRNA表达均高于IL-1β组而正常组和IL-1β+CT组MMP-13的mRNA表达都低于IL-1β组（表7）表7 Realtime RT-PCR结果Group正常组 (略)
3 讨论
1995年国际OA专题研究会提出OA是力学和生物学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者降解和合成失衡的结果。在本实验中HE和大体观察结果提示ACLT+NS 组和Sham组相比软骨基质严重丢失和软骨细胞退变、坏死，这证明ACLT造模成功。目前，有报道证实降钙素受体(CTR)在软骨细胞内存在而且CT能刺激体外培养的软骨细胞的增殖［6］ 。
软骨基质主要成分有水、胶原和蛋白聚糖，其中胶原占软骨基质干重的60%。 关节软骨的诸多胶原表型中Ⅱ型胶原占胶原总量的80% ～85%，均匀分布于整个软骨，对维持关节软骨的弹性及硬度具有重要作用。 在OA中基质金属蛋白酶(MMPS)可以降解Ⅱ型胶原和蛋白多糖(PG)［7］，尤其是MMP-13的降解作用最强。最终使关节软骨基质过度降解，软骨逐渐出现糜烂、溃疡、缺失等一系列退行性变。张楠等［5］发现CT可以抑制蛋白多糖的降解。而在本实验中ACLT+CT组的Mankin评分结果低于ACLT+NS组，MMP-13和Ⅱ型胶原的免疫组化染色光密度值显示CT能降低MMP-13的表达并促进Ⅱ型胶原的分泌或抑制其降解。因此，CT皮下注射5 IU/(kg·d)可以抑制ACLT日本大耳白兔膝关节软骨基质的降解，进而延缓关节炎发生进程。
在体外实验中，含有IL-1β（10ng/ml）的软骨细胞比正常组中MMP-13的表达要高， 这与体内关节炎软骨的细胞微环境相似。用50 ng/ml 的CT对IL-1β组进行干扰，细胞组化和PCR结果均提示CT下调了MMP-13的表达而提高了Ⅱ型胶原的表达，结果与体内试验一致。
软骨下骨的骨小梁、血管和小梁间腔隙，对关节软骨起到机械性和代谢性的保护作用。而在OA进展过程中两者存在着一种恶性循环，软骨下骨结构和代谢改变加促关节退变反之亦然。Behets等［8］造狗前交叉韧带切除OA模型，结果表明软骨下骨小梁改变促进了关节软骨破坏，其机制可能是加强了关节软骨的应力负荷，应力集中导致关节软骨退变。最近有研究已证实在OA中软骨下骨的骨小梁相对体积和厚度都是减少的［9］ 。而本实验中骨形态计量结果显示Sham组与ACLT+NS组相比，骨小梁相对体积和厚度增加，这与以上研究结果一致。Hayami ［10］ 提出软骨下骨骨转换率增高和骨硬化都是OA的重要发病机制，所以通过抑制骨转换可以保护关节软骨，Hayami等［11］还研究建立两种大鼠膝OA模型，发现建模2周后出现软骨下骨丢失，且在软骨明显变薄及软骨下骨硬化前已出现骨吸收，该结果支持软骨下骨重塑在OA病理进程中的作用，并提示骨吸收抑制剂可作为潜在药物用于预防OA疾病进展。本实验骨密度结果显示ACLT+CT组股骨内、外侧髁软骨下骨的骨密度均高于ACLT+NS组，而骨形态计量学提示ACLT+CT组与ACLT+NS组相比，骨小梁相对体积、厚度（Tb.Th）、数量提高，而骨小梁分离度下降。机制可能是CT抑制软骨下骨破骨细胞的活性，降低骨转换率，改善软骨下骨微结构、应力传导和调节软骨下骨的骨代谢，从而减少了软骨下骨正常形态和功能的改变起到对关节软骨的保护作用。Behets等［8］予狗前交叉韧带切除OA模型鳗鱼降钙素鼻饲，结果也得出CT可能对抗骨丢失，纠正关节软骨应力集中，间接减少了软骨损害，这与本试验结论相似。
通过本实验可以看出以5 IU/(kg·d)皮下注射能够抑制ACLT兔膝关节软骨基质的降解，并可能通过调节软骨下骨的骨代谢和微结构进而改善关节软骨的力学环境来间接保护关节软骨； 同时CT（50 ng/ml）能增加体外培养的IL-1β干预的软骨细胞Ⅱ型胶原的含量而抑制MMP-13的表达。因此，作为传统的抗骨质疏松药物，降钙素具备一定的治疗骨性关节炎的作用潜能。
【参考文献】
［1］Nelson KK, Melendez JA. Mitochondrial redox control of matrix metalloproteinases［J］. Free Radic Biol Med , 2004, 37: 768-784.
［2］Massicotte F, Lajeunesse D, Benderdour M,et al.Can altered production of interleukin-1beta, interleukin-6, transforming growth factor-beta and prostaglandin E(2) by isolated human subchondral osteoblasts identify two subgroups of osteoarthritic patients［J］. Osteoarthritis Cartilage, 2002, 10：491-500.
［3］Paredes Y，Massicotte F，Pelletier JP，et al. Study of the role of leukotriene B(4)in abnormal function of human subchondral osteoarthritis osteoblasts: effects of cyclooxygenase and/or 5-lipoxygenase inhibition［J］. Arthritis Rheum, 2002, 46: 1804-1812.
［4］Cranney A，Tugwell P，Zytamk N，et al.Meta-analyses of therapies for postmen-opansal osteoporosis.VI.Meta-analysis of calcitonin for the treatment of postmenopausal osteoporosis［J］.Endocr Rev，2002，23：540-551.
［5］张楠，张柳，郑 桓, 等.降钙素在体内和体外实验中对兔关节炎关节软骨的保护作用［J］.中国矫形外科杂志，2008，16: 66-69.
［6］张楠, 张柳. 降钙素对骨性关节炎中软骨作用的进展研究［J］. 中国矫形外科杂志, 2007, 15: 987-988.
［7］王玉彬，陈安民，郭风劲，等. 基质金属蛋白酶家族在骨关节炎软骨组织中表达的研究［J］. 中国矫形外科杂志, 2007, 15: 853-855.
［8］Behets C, Williams JM, Chappard D,et al.Effects of calcitonin on subchondral trabecular bone changes and on osteoarthritic cartilage lesions after acute anterior cruciate ligament deficiency［J］. J Bone Miner Res, 2004, 19: 1821-1826.
［9］Messent EA, Ward RJ, Tonkin CJ,et al.Osteophytes, juxta-articular radiolucencies and cancellous bone changes in the proximal tibia of patients with knee osteoarthritis［J］. Osteoarthritis Cartilage, 2007, 15: 179-186.
［10］Hayami T, Pickarski M,Wesolowski GA,et al.The role of subchondral bone remodeling in osteoarthritis reduction of cartilage degeneration and prevention of osteophyte formation by alendronate in the rat anterior cruciate ligament transaction model［J］. Arthritis Rheum, 2004, 50: 1193-1206.
［11］Hayami T, Pickarski M, Zhuo Y,et al.Characterization of articular cartilage and sub-chondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis［J］. Bone, 2006, 38: 234-243.
作者单位：华北煤炭医学院附属医院骨科，河北 唐山 063000 基金项目：河北省科技领军人才创新基金项目（NO：06547008D-8）