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[摘 要] 目的 观察不同发育阶段大鼠膀胱组织结构的变化，及连接蛋白connexin 26（Cx26）随组织发育的不同阶段而表达的变化。方法 分别取幼年、成年和老年三组大鼠膀胱，测量排空状态下膀胱壁厚度，用HE和PAS法染色观察膀胱壁组织结构变化，同时用免疫组织化学评价Cx26表达情况。结果 随着膀胱的发育成熟，膀胱壁组织显著增厚，逼尿肌肌纤维增粗，固有层结缔组织增加。早期Cx26在移行细胞层表达较弱，在成年期后稳定高表达。结论 在膀胱的发育过程中，组织结构发生显著变化，成年后移行细胞表达Cx26 显著增强，与膀胱的发育和功能密切相关。
[关键词] 膀胱；connexin 26；组织结构
Changes of tissue structure and Cx26 expression of in rat bladder in different developmental stages
LUO Shun-wen, YE Gang , ZHANG Rong-gui, JIANG Yong-hao
(Department of Urology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
Abstract: Objective To observe the changes of the tissue structure and connexin 26 (Cx26) expression in rat urinary bladder in different developmental stages. Methods Rats were divided into three groups (infant, adult, and the old ). Rat urinal bladders were collected from the 3 groups for measurement of the thickness of bladder wall in empty status. The changes of tissue structure were observed by HE and PAS stainings. Cx26 expression was determined by immunohistochemistry. Results With the development of the bladder, the wall of urinary bladder became thicker, and the fibrin of the detrusor and the connective tissue in basal layer increased. Weak Cx26 expression was found in transitional epithelial cells in the infant urinary bladder, but stably high expression of Cx26 in the adult urinary bladder. Conclusion Significant changes of the tissue structure of the urinary bladder take place during its growth. The increased expression of Cx26 in transitional cells in the adult urinary bladder may be closely associated with the development and functions of the urinary bladder.
Keywords: urinal bladder; connexin 26; tissue structure
随着膀胱的发育成熟，排储尿功能逐渐完善，组织结构发生变化。细胞表面的连接蛋白介导细胞间的通讯和信息交流，在调节细胞生长、促进发育、维持组织细胞间的稳态起重要作用。连接蛋白Connexin26（Cx26）是连接蛋白家族中的一员，许多实验已证实Cx26在膀胱组织中特异性表达，与膀胱组织的发育和功能维持密切相关。本实验通过普通组织切片和免疫组织化学方法，观察不同发育阶段大鼠膀胱的组织结构变化和Cx26的表达情况。
1 材料与方法
1.1 标本
雄性Wistar大鼠（本校动物实验室提供），按实验要求分三组：幼年组（出生1 d的乳鼠），成年组（6月龄），老年组（30月龄）。每组各12只。各组大鼠断颈处死后，立即切开腹壁，眼科镊提起膀胱顶部，沿膀胱颈切下膀胱，充分排空尿液，放入10%福尔马林固定24 h。
1.2 主要试剂
苏木素、伊红、1%过碘酸、Schiff试剂等为本院中心实验室提供，兔多克隆抗体(Cx26) 及SABC试剂盒为博士德公司产品，DAB显色剂为北京中山公司产品。
1.3 膀胱壁厚度测量
剪开膀胱并平展固定好，垂直切开膀胱壁，用标尺测量膀胱壁厚度（为膀胱完全空虚收缩状态的厚度），每个膀胱分别测量3个部位，求平均值。
1.4 组织学观察
各组标本经脱水，石蜡包埋切片，片厚4 μm，HE染色和PAS法染色，分别观察膀胱壁各层细胞和细胞外基质情况。
1.5 免疫组织化学法观察Cx26表达
切片脱蜡、水化后，PBS冲洗3次，每次5 min，加1滴过氧化物酶阻断液孵育10 min。蒸馏水冲洗后，在0.01 mol/L柠檬酸缓冲液中修复抗原，正常山羊血清（1%）孵育20 min，倾去血清滴加一抗（Cx26以1∶100稀释），37 ℃孵育3 h，依次加二抗，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶溶液，37 ℃孵育20 min，DAB显色5 min，冲洗后苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封固。PBS代替一抗作为阴性对照。分别观察移行上皮、固有层和肌层中的表达情况，结果行半定量分析并评分。在高倍显微镜下（×400）观察，计100个细胞，根据着色程度及着色细胞百分数进行判定：阴性（0），整张切片无着色；弱阳性（1），浅黄色，阳性细胞数<30%；阳性（2），棕色，阳性细胞30%～70%；强阳性（3），棕黄色或深棕色，阳性细胞数>70%。
1.6 统计学分析
结果以均值±标准差（ˉx ± s）表示，采用SPSS统计软件，t检验确定差异显著性。
2 结果
2.1 膀胱壁厚度测量
在膀胱排空期，幼年组膀胱壁厚度(0.993±0.026) mm，成年组(1.173±0.037) mm，老年组(1.185±0.045) mm。幼年组比成年组和老年组薄（P<0.01），而成年组和老年组之间无明显差异（P>0.05）。
2.2 膀胱组织结构观察
HE和PAS染色观察各组标本结构完整，移行上皮层和固有层皱缩成乳头状皱襞，肌层由内纵、中环、外纵三层平滑肌组成，各层肌纤维相互交错，分界不清，外膜主要为疏松结缔组织。各组比较可见（图1、2、3）：①幼年组膀胱平滑肌肌束菲薄，排列疏松，PAS胞浆染色较淡，成年组和老年组平滑肌肌纤维发达，PAS染色深红，排列致密；②幼年组膀胱固有层组织少，移行上皮紧挨着内层平滑肌，成年组和老年组固有层结缔组织发达，PAS染色深，约3～5层粗丝状纤维与上皮层平行排列；③成年组和老年组移行上皮排列紧密，游离面平整，出现较多胞浆呈空泡状圆形或巨型“盖细胞”， 幼年组移行细胞排列较紊乱；④老年组和成年组无明显区别。
2.3 Cx26在各组中的表达
免疫组织化学染色结果可见Cx26广泛分布于各层组织（图4、5、6），主要表达在平滑肌细胞和移行上皮细胞，固有层组织中表达微弱，然而在三组中的分布存在显著差异。幼年组Cx26表达较弱，染色淡黄，成年组和老年组移行上皮细胞中呈强阳性表达，染色呈棕黄色或黄褐色。幼年组移行上皮层与其余两组有非常显著差异（P<0.01），三组间肌层和固有层表达无差异（P>0.05）, 积分见表1。表1 各组组织Cx26表达积分(略 )注:与幼年组比较,﹡P < 0.01;在同组中与固有层和肌层比较,﹡P<0.05
3 讨论
膀胱随着个体发育，组织结构不断发育成熟，组织细胞间协同作用完成储尿和排尿功能。其基本组织结构由移行上皮细胞层、固有层结缔组织、逼尿肌层组织和外膜组成，外膜除了在顶部有浆膜外，其余部位为疏松结缔组织。连接蛋白介导缝隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular communication, GJIC）, GJIC在调节细胞生长、促进分化、维持器官功能和组织细胞间的稳态起重要作用[1-2]。
在膀胱发育过程中，组织结构发生了变化，本文通过测量膀胱壁厚度发现成年组和老年组膀胱壁无明显差别，比幼年组膀胱壁显著增厚。通过HE 和PAS染色，观察到膀胱壁增厚主要与逼尿肌肌纤维发达，肌束增宽，固有层结缔组织增多，纤维呈多层条状排列有关。而成年组和老年组膀胱移行上皮层排列比幼年组更加致密，出现较多胞浆呈空泡状圆形或巨型“盖细胞”，与膀胱适应不同阶段的功能有关。
目前已经发现，Cx26是连接蛋白家族中的一员，许多体内外实验证实在膀胱组织中特异性高表达，与膀胱组织细胞的分化成熟及膀胱功能密切相关，在许多疾病中连接蛋白表达异常，如炎症、不稳定膀胱和长期膀胱出口梗阻等疾病，发现连接蛋白表达异常[3]。尤其与肿瘤的关系越来越受关注。在肿瘤组织和肿瘤细胞系中Cx26表达下降，多种致癌因素诱导Cx26表达下降，有实验通过诱导肿瘤细胞Cx26 的高表达，逆转恶性表型，促进细胞凋亡，Cx26是有巨大潜力的抑癌基因[4-6]。Cx26在发育的各个时期表达是否一致？本文认为Cx26在各层组织表达不同，且各个时期表达不尽一致，主要表达在移行上皮细胞中，在幼年期表达较弱，成年期后稳定高表达在移行细胞层。Cx26的表达与膀胱的发育和功能有密切关系。然而Cx26表达的调节机理和在各个发育阶段具体起何作用，尚需进一步研究。
[参考文献]
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[作者简介] 罗顺文（1974-），男，福建省连城县人，主治医师，硕士，主要从事泌尿系肿瘤方面的研究。电话：(023)65221053, Email: luosu2000.student@sina.com
[通信作者] 叶 钢，教授，主任医师。电话：(023)68774624，Email: gye@mail.xinqiaohospital.com.cn
(第三军医大学附属新桥医院泌尿外科，重庆 400037)
（编辑：余汇洋）