急性细菌性腹膜炎对豚鼠小肠Cajal间质细胞的影响

　　［摘要］目的探讨豚鼠腹膜炎模型中小肠Cajal间质细胞网络的变化情况。方法利用腹腔内注射大肠杆菌和10%BaSO4肉汤佐剂的方法建立腹膜炎模型，冰冻切片和全层铺片并结合KIT免疫细胞化学染色观察。结果腹膜炎12～24 h，腹膜炎症状最明显，在切片和铺片上均可见ICCs明显减少，其中ICMY减少最显著，48～96 h后ICCs的数量逐渐恢复正常，同时豚鼠的腹膜炎反应也减轻甚至康复。结论小肠壁内ICCs在腹膜炎模型中可明显减少，但随着时间延长，ICCs逐渐恢复正常的细胞网络。

　　［关键词］ Cajal 间质细胞；KIT蛋白；小肠；腹膜炎

　　Effects of acute bacterial peritonitis on interstitial cells of Cajal in intestinal wall of the guinea pigs

　　GONG Bin, MEI Longcun

　　(the Second People’s Hospital of Yubei District, Chongqing 401147, China)

　　Abstract: ObjectivesTo investigate the changes of interstitial cells of Cajal networks in the guinea pigs model of acute bacterial peritonitis. MethodsPeritonitis models were carried out by injection of bacterium coli and 10% BaSO4 broth adjuvant, ICCs were observed on the frozen sections and wholemount preparation with KIT immunohistochemistry. Results12~24 hours after peritonitis, symptoms of peritonitis were observed and ICCs decreased obviously on both frozen sections and wholemount preparation, especially for ICMY, while 2~4 days later the number and distribution of ICCs restored to normal.ConclusionAcute bacterial peritonitis might lead to temporary loss of ICCs, and it would be soon recovered.

　　Keywords: interstitial cells of Cajal; KIT protein; intestine; peritonitis

　　Cajal间质细胞(interstitial cells of cajal，ICCs)是100多年前Cajal应用镀银技术和甲基蓝染色，在豚鼠和家兔小肠内显示的一种特殊的间质细胞。在胃肠道根据其存在部位，一般分为4种亚型：ICMY位于环形和纵行平滑肌之间的肌间神经丛周围；ICIM位于环行和纵行平滑肌内；ICDMP位于靠近粘膜下层部位的环行平滑肌内的深部肌神经丛附近；ICSM位于结肠环行平滑肌层的内侧，紧靠粘膜下层的部位。不同亚型间ICCs的形态亦存在一定的差异，如ICMY有2个以上的细长突起，胞核椭圆，胞质较少；而ICDMP胞体细长，胞浆丰富［1］。目前已经证明ICCs是胃肠道自主节律性运动的起搏细胞和兴奋传导细胞［2］，在调节消化管的运动功能方面具有重要作用［3］。

　　腹膜炎是临床上常见疾病，可由多种因素引起，并可导致严重的并发症，同时也包括了胃肠道运动障碍，如肠麻痹等。腹膜炎所引起强烈的炎症反应，可能导致慢波波幅和频率降低，但对胃肠道运动的起搏细胞-ICCs有怎样的作用，目前还尚不完全清楚。本研究采用大肠杆菌液腹腔内注射的方法建立腹膜炎模型，并作KIT免疫细胞化学染色，以观察Cajal细胞的变化。

　　1材料与方法

　　1.1 实验动物分组及试剂

　　45～60 d龄豚鼠12只（第三军医大学实验动物中心提供），雌雄不限。实验动物分为4组：致腹膜炎后12 h组、24 h组、48 h组和正常对照组，每组3只动物。主要试剂：KIT单克隆抗体（1∶100）购自eBIOSCIENCE公司，HRP标记的兔抗大鼠IgG抗体（1∶100）购自DAKO公司。

　　1.2实验方法

　　1.2.1腹膜炎动物模型建立实验前禁食12 h，不禁水，大肠杆菌液（3×108）每100 g体重1 ml，结合10%BaSO4牛肉汤作佐剂每只1 ml，无菌状态下，左下腹腹腔注射［4］。

　　1.2.2免疫细胞化学染色在致腹膜炎后12 h、24 h、48 h取相应部位小肠，经生理盐水冲洗后，OCT包埋，冰冻切片，片厚7～10 μm，风干，100%丙酮固定30 min（25 ℃）。染色方法为间接酶标抗体法［5］。切片经0.01 mol/L PBS充分漂洗后，0.03%H2O2/甲醇封闭内源性过氧化物酶20 min（25 ℃），1%BSA孵育30 min后加入第一抗体，KIT单克隆抗体4 ℃，48 h，HRP标记的兔抗大鼠IgG抗体25 ℃，60 min，0.05%TrisHCl/0.05%DAB/0.01%H2O2（pH7.5）显色，镜下观察，适时终止反应，终产物为棕褐色，水溶性封片剂封片。对照实验以正常鼠血清代替一抗，或兔血清代替二抗，结果均为阴性。各步骤间用PBS漂洗3次。取正常对照组豚鼠相应部位小肠进行冰冻切片和全层铺片作为，染色方法同上。

　　1.3半定量分析和统计学处理

　　选取正常和各实验组铺片15张，进行KIT免疫细胞化学染色，应用Imagepro Plus5.0随机计数每平方毫米内的KIT阳性细胞面积，结果以平均值±标准差(±s)表示，应用SPSS11.0软件对数据进行单因素方差分析。

　　2结果

　　腹膜炎动物模型建立成功，豚鼠出现毛发杂乱、少动、少食等症状，在12～24 h最严重，可出现急性弥漫性化脓性炎症，有5%的豚鼠于24 h内死亡。KIT免疫细胞化学染色显示，正常豚鼠空肠的ICCs主要分布在肠壁肌间神经丛周围，深肌丛附近及环行平滑肌内，肠壁全层铺片可见ICMY呈网络状分布于肠壁肌间神经丛周围，细胞体呈梭形或卵圆形，核周胞质少，胞浆着色浅，可见2～4个细长的突起，每个突起有2～3级的分支（图1a、b）。腹膜炎12 h和24 h，切片可见ICMY明显减少，铺片可见距离肌间神经丛越远的ICCs减少越明显，细胞网络被破坏（图1c）。48 h较24 h ICCs有明显增加（图1d），至96 h时基本恢复正常分布。计算每平方毫米内KIT阳性面积的变化，结果显示正常小肠KIT阳性面积为（0.228±0.121） mm2，KIT免疫细胞化学染色而腹膜炎12 h、24 h和48 h分别为（0.152±0.057）mm2、（0.158±0.068）mm2和（0.198±0.077）mm2。统计学分析显示，各实验组与正常组间均有显著性差异（P<0.05），见图2。

　　a:正常小肠切片; b:正常小肠铺片; c:腹膜炎12 h小肠铺片; d:腹膜炎48 h小肠铺片

　　图1豚鼠小肠切片及铺片（略）

　　图2各组每平方毫米内KIT阳性细胞面积（略）

　　3讨论

　　ckit为一种原癌基因，位于人染色体4q1112，为白色斑点显性基因（dominant white spotting）的等位基因，编码干细胞因子（stem cell factor）的Ⅲ型酪氨酸激酶受体(Kit受体)，该受体分为游离型和膜结合型两种。应用抗ckit蛋白的抗体于胚胎晚期或出生前注射阻断Kit受体的功能，ICCs的正常发育会受到严重的影响。Huizinga等［2］对自发性ckit 基因突变的小鼠研究表明，ckit基因丢失的小鼠胃肠道呈扩张性肠麻痹，肌间神经丛周围，ckit mRNA表达的阳性细胞明显减少，细胞网络缺如，肌间神经丛附近的电慢波消失［6］。上述研究表明KIT蛋白可作为胃肠道ICCs的一种特异性标志物，为研究ICCs提供了有力的手段。

　　急性细菌性腹膜炎是一种严重的疾病，可导致脓毒血症、休克等严重的并发症，其中包括了胃肠道运动功能障碍，表现为肠麻痹、肠梗阻等。ICCs可产生慢波，是胃肠道运动的起搏细胞。急性细菌性腹膜炎引起严重的炎症反应，聚集了大量的炎症细胞并产生较多的炎症介质。这些炎症介质如：IL2、白三烯、NO等均对细胞有一定的损伤作用。在本实验中，可见腹膜炎后ICCs尤其是肌间神经丛部位明显减少，可能是由于腹腔的炎症介质弥散进入肌间神经丛部位，损伤了ICCs，从而导致部分ICCs消失。随着时间延长，腹膜炎逐渐好转，炎症介质也减少，ICCs逐渐恢复正常的分布。虽然ICCs在成年豚鼠可增殖［7］，但ICCs的这种变化可能是由于KIT表型在损伤因素存在情况下丢失所引起的，而不是ICCs增殖引起。

　　总之，ICCs作为胃肠道运动的起搏细胞，在炎症介质的影响下，可出现KIT表型丢失，但随着炎症的消失，表型可恢复正常，可以推测急性细菌性腹膜炎对ICCs的影响是功能性和一过性的。

　　［参考文献］

　　［1］ Komuro T, Tokui K, Zhou DS. Identification of the interstitial cells of Cajal［J］. Histol Histopathol, 1996,11(3):769-786.

　　［2］ Huizinga JD, Thuneberg L, Kluppel M, et al. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity［J］. Nature, 1995,373(6512):347-349.

　　［3］ 胡晔东，林琳，张红杰，等. Cajal间质细胞与一氧化氮在吗啡诱导慢传输运动小鼠结肠中的改变［J］. 中国临床康复, 2005,9(44):134-136.

　　［4］ 王玉琨，高静涛，王乃玉，等. 大白鼠大肠杆菌性腹膜炎模型的建立［J］. 大连医科大学学报, 1996,18(2):81-82.

　　［5］ Komuro T, Zhou DS. Antickit protein immunoreactive cells corresponding to the interstitial cells of Cajal in the guineapig small intestine［J］. J Auton Nerv Syst, 1996,61(2):169-174.

　　［6］ Kito Y, Ward SM, Sanders KM. Pacemaker potentials generated by interstitial cells of Cajal in the murine intestine［J］. Am J Physiol Cell Physiol, 2005,288(3):C710-C720.

　　［7］ Mei F, Yu B, Ma H, et al. Interstitial cells of Cajal could regenerate and restore their normal distribution after disrupted by intestinal transection and anastomosis in the adult guinea pigs［J］. Virchows Arch, 2006,449(3):348-357.

　　（编辑：余汇洋）

　　（重庆市渝北区第二人民医院，重庆 401147）