一氧化氮在高胆固醇血症家兔Oddi括约肌中的含量变化

【摘要】  　　目的探讨一氧化氮在高胆固醇血症家兔Oddi括约肌中的变化。方法将32只成年家兔随机分成正常对照组、高胆固醇血症4周组、6周组、10周组，每组8只，分别以高胆固醇饲料喂养，取其Oddi括约肌用硝酸还原酶法行一氧化氮含量检测。结果家兔喂养高胆固醇饲料后可形成高胆固醇血症，Oddi括约肌中一氧化氮的含量明显改变（P＜0.05）。结论高胆固醇血症家兔Oddi括约肌一氧化氮含量降低；高胆固醇血症通过影响NO的含量改变Oddi的舒张功能。

【关键词】  高胆固醇血症　Oddi括约肌　一氧化氮

　　Nitric oxide changes of sphincter of Oddi in rabbits with hypercholesteremia

    WANG Xiaojun，ZHU Zhili，LI Hucheng，DONG Jiahong (Department of Hepatobiliary, Southwest Hospital，Third Military Medical University, Chongqing  400038,  China)

    Abstract: Objective To investigate the changes of nitric oxide in sphincter of Oddi (SO) of hypercholesteremia rabbits.  Methods A total of 32 rabbits were randomized into 4 groups. In control group, the rabbits were fed with normal diet. In experimental groups, the animals were fed with normal diet + cholesterol for 4, 6,10weeks. The content of nitric oxide were examined in SO of all animals by nitrate reductase method.  Results  The rabbits fed with normal diet + cholesterol suffered hypercholesteremia; In the experimental group, the content of nitric oxide in SO was significantly lower (P﹤0.05). Conclusion Nitric oxide in SO is lower in hypercholesteremia animals. The hypercholesteremia may influence the relaxation function of SO because of NO.

    Keywords: hypercholesteremia; sphincter of Oddi; nitric oxide

    胆固醇升高是胆囊结石形成的基础，其对Oddi括约肌（sphincter of Oddi，SO）的作用报道多见于结石形成的因素探讨，而对于SO本身的影响报道较少，有研究显示一氧化氮（nitric oxide，NO）在SO的运动中有着重要的作用。本实验通过建立高胆固醇血症模型对Oddi括约肌中的一氧化氮含量进行检测，初步了解和探讨高胆固醇血症下NO的含量变化情况以及对SO功能的作用。

    1材料与方法

    1.1动物模型的建立

    家兔32只，雌雄不限，年龄3~4月，体重2~3 kg，均来自第三军医大学实验动物中心。随机分为4组：正常对照组和高胆固醇血症4周、6周、10周组，每组8只。高胆固醇血症模型的建立：对照组饲以标准饲料；实验组饲以掺有1.2%胆固醇（成都市科龙化工试剂厂，99.5%）的标准饲料，制作实验性高胆固醇血症模型。动物模型判定标准：兔血清总胆固醇＜3.0 mmol/L为正常，＞10 mmol/L为高胆固醇血症。实验开始前将血清总胆固醇＞3.0 mmol/L兔剔除［1］。

    1.2手术方法

    实验前禁食14~18 h，禁水4 h。速眠新(解放军农牧大学制药厂，0.2 ml/kg)肌注麻醉，备皮，术中速眠新（0.1 ml/kg）肌注维持麻醉。麻醉满意后，经腹中线开腹，切开十二指肠，暴露乳头。逆行插入一导管，沿导管取SO组织约10 mm长，进行修剪后迅速置入液氮中保存。手术结束后空气注射处死，迅速抽取心脏血，离心后取上清检测肝功能变化。

    1.3NO含量的检测

    将已保存好的SO组织匀浆，参照试剂盒说明书用硝酸还原酶法直接检测局部SO组织中蛋白的含量以及NO含量的变化情况。

    1.4胆囊胆汁胆固醇结晶及结石判断标准

    肉眼观察胆汁内有成形粗大颗粒,光镜下观察为致密大团块结晶，即定为结石［2］，正常兔胆囊胆汁均未见有形成分。胆固醇结晶定量：取部分胆囊胆汁离心，沉淀物涂片，光镜下观察有无胆固醇结晶。胆固醇结晶定量参照Juniper标准分为+，++，+++ 及++++四个等级。

    1.6统计方法

    采用SPSS13.0软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差(±s)表示，两组间样本均数比较采用ｔ检验，P＜0.05为差异显著。

    2结果

    2.1实验动物一般情况及体重变化

    对照组动物生长良好，平均每周体重增加0.05~0.1 kg。实验组动物饲高胆固醇膳食后生长较快，体重增长明显，每周平均增长0.10~0.20 kg。各组动物喂养期间均无死亡。

    2.2胆固醇结晶形成情况

    胆固醇结晶与成石情况：对照组胆囊胆汁几乎无胆固醇结晶（0~±），高胆固醇膳食4周组胆固醇结晶开始增加（+++~++++），6周组及10周组明显增加（++++）；4周组未观察到明显结石，6周组4/8只、10周组7/8只出现结石。

    2.3血清胆固醇变化情况

    给予高胆固醇饮食喂养家兔后，血清中总胆固醇含量增加明显，主要为低密度脂蛋白的增加（P＜0.05），而高密度脂蛋白略有降低或不明显。表1血清胆固醇含量的比较

    2.4NO含量检测

    与对照组相比，实验组NO含量随着喂养时间的延长而持续降低：实验4周组1.56±0.28；实验6周组1.23±0.09；实验10周组0.61±0.16；对照组3.49±0.69；与对照组比较相差显著（P＜0.05）。其结果见图1。

    3讨论

    一氧化氮是内皮细胞释放的一种化学性质不稳定，生物半衰期仅5 s左右的小分子生物活性物质，在正常生理状态下也存在［3］。体内代谢转化为硝酸盐NO3－和亚硝酸盐NO2－，血清NO3－与NO2－浓度之和才能准确代表体内NO水平。血清和组织两者之和含量测定，国内现有的单位采用金属镉还原法，但该法操作烦琐，需除蛋白，反应不容易控制（金属可将NO2－进一步还原），且不能完全将NO3－还原成NO2－，准确性差。本实验采用硝酸还原酶法检测SO组织中NO含量的变化情况。内源性NO由左旋精氨酸(LNAA)在NO合成酶(NOS)作用下生成。NOS作为NO合成过程中唯一的酶，其活性变化直接调节NO的生成量及其生物学效应。免疫组化研究发现NOS广泛存在于哺乳动物及人胃肠道组织中［4］。近年来的研究证实了NO为肠神经系统中非肾上腺素能、非胆碱能神经(nonadrenergic，noncholinergic，NANC)的主要抑制性神经递质，它们作为一种肽能神经递质主要以神经分泌方式在局部起作用，并非以循环激素方式发挥作用［5］。

    在本实验中，我们建立了高胆固醇血症模型并进行了NO的测定，结果发现，给予家兔以高胆固醇饲料喂养后，其血清胆固醇含量明显升高，胆汁中出现结晶甚至结石，表明进食高胆固醇饲料可形成家兔的结石模型，与文献报道的较为一致［1］，家兔本身对胆固醇膳食的敏感性较高，对外源性胆固醇吸收率达75％~95％，对高胆固醇血症清除能力低，易于建立模型。对各实验组测定其一氧化氮含量发现，给予高胆固醇血症饲料喂养后，随着饲养时间的延长，其一氧化氮含量明显降低，提示高胆固醇血症影响了NO的合成。结合相关研究，提示在高胆固醇饲料喂养的前提下，SO中NO含量受到影响，从而影响SO的运动变化。

    既往的研究中，在高胆固醇饲料喂养的条件下，SO运动功能增强［6］， SO提高了张力，以限制胆汁直接、不间断地排入十二指肠和维持胆总管内的压力；同时SO增加了蠕动，加速胆汁排泄以代偿，提示相关因素在SO功能变化中可能起重要作用。Simula等研究发现，正常情况下Oddi括约肌中分布有大量NOS免疫活性产物，它们在调节Oddi括约肌功能方面可能具有重要作用［7］。实验表明，给予离体或在体SO予以NO供体，如硝酸甘油、硝普钠等可引起SO的舒张，抑制SO的运动［8］。其作用机制主要为：NO可激活鸟苷环化酶,使cGMP含量升高,后者一方面降低Ca+浓度或收缩成分对Ca+的敏感性，引起肌肉松弛；另一方面使依赖cGMP的蛋白激酶活性上升,促使蛋白磷酸化使肌肉松弛［9］。本实验中，给予高胆固醇饲料喂养后，血液以及胆汁中的高胆固醇水平可能通过破坏NO生成的底物戊基亚硝酸盐，抑制了NO的生成，从而成为导致SO的运动功能增强的主要因素［10］。

    通过上述实验我们可以发现高胆固醇血症中，NO对家兔的SO运动功能存在一定影响，血清NO和局部组织中的变化情是否况一致还需要进一步研究。据此可在术前对部分胆囊切除术后综合征患者行SO功能的检测评估以及对症治疗，但其作用机制尚需进一步进行深入的探讨。

【参考文献】
  　　［1］ 赵纪春，舒晔，程南生，等. 胆囊结石中胆固醇代谢变化的实验研究［J］. 中国普通外科杂志，2000，9（2）:124-128.

［2］ 张孝勇，魏经国，马进，等.高胆固醇血症兔Odii括约肌张力的变化机制［J］.世界华人消化杂志，2004,12（5）∶1114-1118.

［3］ 孙龙安. 医学特种检验与实验室诊断［M］. 北京：人民军医出版社，2002.99.

［4］ 张敏,张学平，张连巍，等.家兔Oddi括约肌NOS阳性神经元的分布及其对该括约肌肌电的影响［J］.河北医科大学学报，2003，24（6）：325-328.

［5］ Konturek SK, Konturek PC. Role of nitric oxode in the digestive sysytem［J］. Digestion, 1995,56(1):1-13.

［6］ 魏经国，杜凡，王耀程，等. 高胆固醇诱发Oddi括约肌功能紊乱实验研究［J］. 中国病理生理杂志， 2000，16（5）：446-450.

［7］ Jia L, Stamler JS. Dual actions of Snitrosylated derivative of vasoactive intestinal peptide as a vasoactive intestinal peptidelike mediator and nitric oxide carrier［J］. Eur Pharmaco, 1999,366(1):79-86.

［8］ Luman W, Pryde A, Heading RC, et al. Tropical glyceryl trinitrate relaxes the sphincter of Oddi［J］. Gut,1997,40(4):541-543.

［9］ Zhang J,Snydee SH. NO in the nervous system［J］. Annu Rew Pharmacol Toxicol, 1995, 35(2):213-216.

［10］ Szilvassy Z, Nagy I, Madacsy L, et al. Beneficial effect of lovastatin on sphincter of Oddi dyskinesia in hypercholesterolemia and hypertriglyceridemia［J］. Am J Gastroenterol, 1997,88(4):900-902.

作者单位：第三军医大学：1.附属西南医院肝胆外科研究所；2.基础医学部外科应用解剖与手术学教研室，重庆 400038