降钙素家族中的肽和受体在骨代谢调节中的角色

【关键词】  降钙素;降钙素受体;成骨细胞;破骨细胞;受体活性修饰蛋白

　降钙素存在于许多物种中，其中鲑鱼降钙素虽然仅分享了与人体降钙素50%的同源性，但在大多数生物化验中却显示出比人体降钙素更大的效力[12]。降钙素家族包括许多与降钙素结构相似的肽类激素：降钙素基因相关肽(CGRP)，胰淀素，肾上腺髓质素和肾上腺髓质素2(中间素)。降钙素家族的其他两个成员是肾上腺髓质素和肾上腺髓质素2。肾上腺髓质素是一种具有降压作用的最初由人体嗜铬细胞瘤分离出来的由52个氨基酸组成的肽类激素，也在各种其他组织中表达。现将降钙素家族中的肽和受体在骨代谢调节中的角色综述如下。

　　1 骨肽中降钙素家族的影响

　　1.1 破骨细胞和骨吸收

　　血液中钙水平的迅速降低，主要是降钙素对骨吸收抑制的结果[3]。降钙素的骨吸收活性导致它可以应用于高骨代谢疾病的治疗。与降钙素相似，胰淀素注射液或降钙素基因相关肽降低了血浆中的钙水平，虽然在大多数实验系统中这些肽比降钙素在诱导低钙血症时的能力低了几个数量级。降钙素对骨骼的作用机制的研究表明降钙素与特定受体结合诱导了破骨细胞的形态改变，而产生了抑制骨吸收的结果。降钙素，降钙素基因相关肽和胰淀素抑制破骨细胞活性，通过CAMP相关机制达到静止。降钙素短期治疗对多核抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性细胞的数量没有影响[45]。

　　1.2 成骨细胞和骨形成

　　降钙素家庭中不同的多肽在调节骨形成和对成骨细胞的直接影响中能力各有不同，降钙素对成骨细胞直接作用的证据少之又少。虽然在许多动物模型中降钙素增加了骨的生长以及骨形成的生化指标[6]，但这些可能一直都只是次要和间接作用的结果。胰淀素，降钙素基因相关肽和肾上腺髓质素刺激成骨细胞的体外增殖并增加体内的骨形成指标[7]。胰淀素和肾上腺髓质素分别在拟生理剂量浓度10-11M与10-12M时刺激大鼠原始成骨细胞的增殖。在这个系统中降钙素基因相关肽仅在浓度高于10-8M是具有活性，而降钙素对细胞增殖没有明显影响。胰淀素在人成骨细胞中具有类似的增殖作用[6]。在局部注射模型中，通过每天对半颅脑的成年小鼠实施多肽的皮下注射，胰淀素和肾上腺髓质素显著增加骨面积和矿化骨面积，而胰淀素和降钙素对骨表面的侵蚀有显著的抑制作用，因此抑制骨吸收。从肽的体外实验和局部以及系统管理的体内实验的证据表明降钙素，胰淀素和降钙素基因相关肽抑制破骨细胞和骨吸收，而胰淀素，降钙素基因相关肽和肾上腺髓质素普遍提高成骨细胞增殖和骨形成。肽的相对效力依赖于实验系统，虽然降钙素似乎有着最大的通过抑制骨吸收而降低血钙的活性，而胰淀素似乎有着最强同化效应的肽。

　　2 多肽降钙素家族的受体

　　降钙素家族中的肽的受体由两个七跨膜域G蛋白偶联受体蛋白结合而成;降钙素受体(CTR)和降钙素受体样受体(CLR)具有三个受体活性修饰蛋白(RAMPs)。第一个降钙素家族的一个成员多肽的特定受体的序列与II类G蛋白偶联受体同源，一组包括其他与调节肽结合的受体，如甲状旁腺激素/甲状旁腺激素相关肽和肠促胰液素。受体活性修饰蛋白1被麦克莱特切等人发现,他筛选了一个人类神经母细胞瘤细胞连接爪蟾卵母中的人神经上皮瘤细胞互补DNA库的表达，目的是克隆一个特定的降钙素基因相关肽受体。他们表明，受体活性修饰蛋白1与降钙素受体样受体联合表达时，有一个与人神经上皮瘤细胞降钙素基因相关肽受体相同药理的降钙素基因相关肽受体的重组。在一个序列数据库中搜索与受体活性修饰蛋白1表达相似的序列以确定受体活性修饰蛋白2和受体活性修饰蛋白3序列。虽然三个受体活性修饰蛋白显示只有大约30%的氨基酸序列相同，但他们有着相似的基本结构：一个大的胞外区含有4个保守的半胱氨酸残基，一个跨膜区，和一个短的细胞内区域。相对于受体活性修饰蛋白1，受体活性修饰蛋白2或3与降钙素受体样受体的联合表达不能使在爪蟾卵母中降钙素基因相关肽的反应成为可能，且与降钙素家族的其他配体的筛选表明无论受体活性修饰蛋白2或3与CLR的结合都构成特定的肾上腺髓质素受体。随后的研究表明，受体活性修饰蛋白不仅决定了降钙素受体样受体的配体的特异性，也可以与降钙素受体以相似的方式相互作用，且降钙素受体与三个受体活性修饰蛋白中的任一个的异类二聚产生特定的胰淀素受体[78]。降钙素家族受体与其配体之间相互作用的详细分析显示了一些受体的结合有一定程度的交叉反应。而且很明显，具体的亲和力依赖于实验系统。除了表1中详述的配体，肾上腺髓质素2以高亲和性的非选择性的方式和降钙素受体样受体与任一种受体活性修饰蛋白的组合相联结。

　　3 降钙素家族多肽及其受体基因缺乏的小鼠的骨型

　　一只CALCA基因缺陷的基因敲除小鼠，降钙素与α降钙素基因相关肽两者的编码都有一个意想不到的表型。此前，许多在体外、体内和临床的研究表明，降钙素是骨吸收抑制剂，预测：CALCA缺陷小鼠将由于加快了骨吸收而有骨质疏松症。然而，动物具有较高的骨量和骨小梁数目导致骨形成大增，这意味着，降钙素或α降钙素基因相关肽对骨形成的一种抑制作用。对这些动物骨表型一连串的长期研究表明，在CALCA缺陷小鼠中骨表型会随年龄演变，在12和18个月时，随着骨形成的增加有证据证明骨吸收也随之增加[9]。20%的CALCA缺陷小鼠由于高骨转换导致骨肥厚性病变。很难阐释降钙素对CALCA缺陷小鼠的骨代谢调节的生理作用，因为这些动物具有既缺乏降钙素又缺乏α降钙素基因相关肽的复杂的基因型。此外用于这些研究的动物具有混合遗传背景，而在最近的一份出版物中，繁殖CALCA缺陷小鼠到一个纯C57/B6老鼠背景时产生了一种能使小梁变薄，皮质重塑逐渐增加的不同表型。生产α降钙素基因相关肽缺陷小鼠是为了研究降钙素基因相关肽在骨中的具体作用[10]。α降钙素基因相关肽缺陷小鼠有因骨形成减少造成的骨质疏松，表明了α降钙素基因相关肽的生理作用类似于一个骨形成的活化剂。由于降钙素受体缺乏小鼠是不可行的，所以两种用来替代的基因敲除动物模型被开发出来以研究降钙素受体的生理作用。降钙素受体单倍剂量不足产生于降钙素受体在破骨细胞中的表达是野生型小鼠的一半的杂合子CTR+/-小鼠中。这些动物由于骨形成增加而对骨吸收没有变化所以具有高骨量，与最初描述的CALCA缺陷小鼠的表型相似。用于研究降钙素受体在骨代谢中生理作用的第二个动物模型最近已经被描述。删除降钙素受体基因94%以上100%以下的全球性可行的降钙素受体基因敲除小鼠，利用肌酐/loxP系统被开发出来。这些动物的研究表明，降钙素受体在骨以及基础状态中的钙稳态的生理调节具有不太重要的作用，但在钙压力的条件下发挥着重要作用。

　　4 骨骼中降钙素家族受体的表达

　　在破骨细胞谱系的细胞中，降钙素受体在单核细胞前体中是检测不到的，但其表达在破骨细胞被诱导，在细胞融合和多核破骨细胞形成之前它是高表达的。在最近的一份出版物中，小鼠骨髓巨噬细胞显示出对降钙素基因相关肽，胰淀素，肾上腺髓质素和肾上腺髓质素2受体的表达，而降钙素受体仅在细胞与配体治疗后表达。破骨细胞样细胞的单纯种群的制备是用激光捕获显微切割小鼠骨髓和脾细胞的共培养而来的，中村等人展示了受体活性修饰蛋白2，降钙素受体，降钙素受体样受体的表达，而受体活性修饰蛋白1和受体活性修饰蛋白3的表达是无法检测到的[11]。在成骨细胞谱系中，降钙素家族受体在大量的啮齿动物的细胞系与原代细胞中进行了调查。UMR106大鼠骨肉瘤细胞系分为两个亚克隆：UMR10601，是无法与鲑鱼降钙素结合也无法对鲑鱼降钙素有回应的，和UMR10606，在培养的长期保留后显示出表型改变的一个亚克隆，兼有与鲑鱼降钙素结合和对鲑鱼降钙素有回应的能力[12]。我们用RTPCR技术和Northern杂交分析去研究大鼠原代破骨细胞和UMR10606细胞中降钙素家族受体的表达。降钙素受体样受体的表达同时发生在原代成骨细胞和UMR10606中，而降钙素受体的表达仅发生在细胞系中，而原代细胞中则没有。受体活性修饰蛋白1的表达在一个非常低的水平，受体活性修饰蛋白2的表达同时发生在原代成骨细胞和UMR10606中，而受体活性修饰蛋白3的表达发生于原代细胞中，在细胞系中的表达仅仅是非常低的水平。这里有一些降钙素家族受体组件的表达具体调控的证据。在一个调查小鼠原代成骨细胞用甲状旁腺激素处理后的基因表达变化的研究中，受体活性修饰蛋白3被确定为靶基因之一[13]。使用实时PCR来衡量降钙素受体，降钙素受体样受体和受体活性修饰蛋白13在从病人接受骨科手术时收集的32个人骨样本中的表达。

　　5 降钙素家族多肽及其受体对骨代谢的调节

　　许多关于降钙素家族多肽及其在骨中受体的活性的问题仍然悬而未决。大批证据显示降钙素的实施诱导骨吸收的抑制，在CALCA缺陷的小鼠中骨形成的增加表明降钙素作为骨形成抑制剂具有一个意想不到的生理作用。也有一些言论，认为降钙素受体可能具有额外配体。到目前为止，降钙素受体和降钙素受体-受体活性修饰蛋白二聚体的两个配体已经确定是：降钙素和胰淀素。然而，虽然降钙素受体缺陷是会导致胚胎死亡的，但是降钙素/α降钙素基因相关肽缺陷和胰淀素缺陷的小鼠是可行的，这意味着胰淀素降钙素双双敲除的基因敲除小鼠可能会致死，或者额外的降钙素受体的存在。研究显示了人成骨细胞和骨髓细胞中降钙素受体样受体与受体活性修饰蛋白表达的高相关水平，预示了一个与降钙素基因相关肽具有高亲和力的受体表型，而降钙素基因相关肽一般比骨中其他降钙素家族中多肽效力要小。

　　总之，在使用不同的实验系统和不同物种进行降钙素多肽及其受体在骨中的研究产生了很多并不总是一致的有趣的结果。事实上，无论动物缺陷降钙素，降钙素基因相关肽还是胰淀素都与野生型对照组的骨型有所不同，这表明这些肽是骨代谢的生理调节器。然而，对骨中降钙素多肽的生理作用理解，我们需要对现有的动物模型以及有条件的基因敲除动物进行更严格的调查。在这些动物模型中，降钙素家族中多肽对骨调节和钙代谢的意义可能确定在各种不同条件下的钙压力，如怀孕、哺乳和低钙饮食。细胞和分子生物学方法与整个动物模型的研究一起得到的结果有可能找到阐明骨中降钙素多肽作用机制的缺失组件。

【参考文献】
  　[1] Poyner DR,Sexton PM,Marshall I,et al.International Union of Pharmacology.XXXII.The mammalian calcitonin generelated peptides,adrenomedullin,amylin,and calcitonin receptors[J].Pharmacol Rev,2002,54(2):233-246.

　　[2] Huebner AK,Schinke T,Priemel M,et al.Calcitonin deficiency in mice progressively results in high bone turnover[J].J Bone Miner Res 2006;21(12):1924-1934.

　　[3] 徐 格,吴雪晖,许建中,等.人骨髓间充质干细胞表面CGRP受体存在的研究[J].华南国防医学杂志,2008,22(2):15-17.

　　[4] Davey RA,Turner AG,McManus JF,et al.Calcitonin receptor plays a physiological role to protect against hypercalcemia in mice[J].J Bone Miner Res,2008,23(8):1182 1193.

　　[5] Davey RA, Moore AJ, Chiu MW,et al.Effects of amylin deficiency on trabecular bone in young mice are sexdependent[J].Calcif Tissue Int,2006,78(6):398-403.

　　[6] Dackor RT,FritzSix K,Dunworth WP,et al.Hydrops fetalis, cardiovascular defects, and embryonic lethality in mice lacking the calcitonin receptorlike receptor gene[J].Mol Cell Biol,2006,26(7):2511-2518.

　　[7] Dackor R,FritzSix K,Smithies O,et al.Receptor activitymodifying Proteins 2 and 3 have distinct physiological functions from embryogenesis to old age[J].J Biol Chem,2007,282(25):18094-18099.

　　[8] Tsujikawa K,Yayama K,Hayashi T,et al.Hypertension and dysregulated proinflammatory cytokine production in receptor activitymodifying protein 1deficient mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(42):16702-16707.

　　[9] Lerner UH.Deletions of genes encoding calcitonin/alphaCGRP, amylin and calcitonin receptor have given new and unexpected insights into the function of calcitonin receptors and calcitonin receptorlike receptors in bone[J].J Musculoskelet Neuronal Interact,2006,6(1):87-95.

　　[10] 何海涛,谭颖徽,王建华,等.P物质在去下牙槽神经下颌骨骨折愈合中的表达[J].实用口腔医学杂志,2007,23(3):423-425.

　　[11] Granholm S,Lundberg P,Lerner UH.Expression of the calcitonin receptor,calcitonin receptorlike receptor, and receptor activity modifying proteins during osteoclast differentiation[J].J Cell Biochem,2008,104(3):920-933.

　　[12] Phelps E,Bezouglaia O,Tetradis S,et al.Parathyroid hormone induces receptor activity modifying protein3 (RAMP3) expression primarily via 3′,5′cyclic adenosine monophosphate signaling in osteoblasts[J].Calcif Tissue Int,2005,77(2):96-103.

　　[13] Naot D,Bava U,Matthews B,et al.Differential gene expression in cultured osteoblasts and bone marrow stromal cells from patients with Paget’s disease of bone[J].J Bone Miner Res,2007,22(2):298-309.