膳食诱导肥胖抵抗大鼠下丘脑NPY mRNA及蛋白的表达

　　【摘要】目的 研究膳食诱导肥胖（DIO）及肥胖抵抗（DIO-R）大鼠下丘脑弓状核神经肽Y mRNA及蛋白表达情况，探讨神经肽Y与肥胖抵抗的关系。方法 高脂饮食建立DIO与DIO-R大鼠模型，分别于2周、12周末处死，采用原位杂交和免疫组化方法检测下丘脑弓状核神经肽Y的 mRNA和蛋白表达情况。结果 实验2周末，DIO大鼠神经肽Y mRNA和蛋白阳性面积分别为(0.563 8±0.100 5),(0.610 9±0.143 4)mm2，高于DIO-R（0.411 5±0.085 1)，(0.523 1±0.096 3）mm2和对照组大鼠（0.400 4±0.062 2)，(0.445 3±0.157 8）mm2；神经肽Y mRNA和蛋白积分光密度分别为9 025.48±2 192.32，7 786.39±1 423.02，高于DIO-R（7 651.79±2 279.21，5 447.16±3 207.09）和对照组大鼠（6 499.24±2 342.94，5 530.83±841.13）。结论 神经肽Y mRNA和蛋白表达降低且保持敏感性可能与肥胖抵抗有关。

　　【关键词】 膳食配方；肥胖症；大鼠，近交系；下丘脑；蛋白质类

　　Study on the Neuropeptide Y mRNA and Protein Expression of Dietinduced Obesity Rats

　　ZHAI Lingling, YAO Xingjia, ZHAO Jian, et al.

　　Department of Child and Adolescent Health, College of Public Health, China Medical College,Shenyang (110001), China

　　【Abstract】Objective To investigate NPY mRNA and protein expression in the arcuate nucleus of hypothalamus of dietinduced obesity(DIO) and dietinduced obesity resistant(DIOR) rats, and to explore the relationship between NPY and obesityresistant. Methods The DIO and DIOR rat models was established by high fat diet. The rats were killed in 2 and 12 weeks. Situ hybridization and immunohistochemistry were used to measure the expression of NPY mRNA and protein in the rats. Results       After 2 weeks of diet, the areas of NPY mRNA and protein expression of DIO rats were(0.563 8±0.100 5)mm2 and(0.610 9±0.143 4)mm2, higher than those of DIOR(0.411 5±0.085 1,0.523 1±0.096 3) and the control rats(0.400 4±0.062 2,0.445 3±0.157 8). The IOD of NPY mRNA and protein expression of DIO were 9 025.48±2 192.32 and 7 786.39±1 423.02, higher than DIO-R (7 651.79±2 279.21,5 447.16±3 207.09) and the control rats (6 499.24±2 342.94,5 530.83±841.13). Conclusion  Decreased NPY mRNA and the kept NPY sensitivity might be related to obesityresistant.

　　【Key words】 Dietary formulations;Obesity;Rats,inbred strains;Hypothalamus;Proteins

　　肥胖被视为一种以身体脂肪含量过多为主要特征的、原因复杂的、能够合并多种疾患的慢性病。在我国，肥胖已经成为21世纪最常见的健康问题之一。1983年Levin等［1］发现“肥胖抵抗现象”，肥胖抵抗发生原因的研究将成为肥胖病因研究的新途径之一。

　　NPY是作为神经系统递质作用的一种具有36个氨基酸的蛋白质。它的生物学作用比较广泛，许多资料表明NPY可以改变摄食行为，包括食物摄入、碳水化合物的代谢，NPY与脂肪调节关系明显。笔者通过检测下丘脑NPY mRNA及蛋白表达情况，以探讨NPY与肥胖抵抗的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物      

　　雄性Wistar大鼠48只，体重(200±20)g。动物随机分为2组：第1组为24只，随机分对照组6只，实验组18只，实验2周末处死；第2组24只，随机分对照组6只，实验组18只，实验12周末处死。对照组给予基础饲料，实验组给予高脂饲料。

　　1.1.2       试剂与饲料      

　　NPY免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。NPY cDNA单链寡核苷酸探针购于Takara公司，试剂盒购于美国Invitrogen公司。实验选用合成饲料［2］。

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织材料的准备      

　　大鼠分别饲养2周、12周，禁食12 h，下腔静脉取血，每一动物下丘脑弓状核平面（根据大鼠立体定位图谱，矢状切面，由正中线向外侧0.3 mm），间歇取4张切片,片厚13 μm，切片自然干燥后于-70℃深冻冰箱保存待测。

　　1.2.2 膳食诱导肥胖(DIO)与肥胖抵抗(DIO-R)大鼠的判定［3］      

　　高脂喂养2周、12周后，体重增加位于前6位的大鼠判定为DIO大鼠，体重增加位于后6位的大鼠为DIO-R大鼠，介于两者之间的弃之。

　　1.2.3 指标的测定      

　　NPY蛋白测定，免疫组化链霉素合素——过氧化物酶复合物（SABC）方法，灭活内源性过氧化物酶，然后依次滴加正常的山羊血清封闭液、-抗兔抗大鼠NPY抗体、生物素标记山羊抗兔抗体和试剂SABC，DAB显色，阴性对照一抗为PBS。NPY mRNA测定，采用原位杂交的方法，冰冻切片脱水，然后进行预杂交，灭活内源性过氧化物酶，并进行蛋白酶消化，加入生物素-cDNA-探针进行杂交，杂交后处理，加入Streptavidin HRP液，DAB显色；阴性对照实验未加探针杂交。采用图像分析系统（MetaMorph Image System v4.6）进行结果判定，每只动物选取2张切片，每张切片选取2个40倍镜下视野。选取弓状核中央区域［3］进行阳性区域面积、积分光密度值测量，取均值。

　　1.2.4统计分析      

　　运用SPSS统计软件进行统计学分析，实验数据用(x±s)表示，各指标比较采用单因素方差分析，随后采用最小显著差法(LSD)进行两两比较。

　　2 结果

　　2.1 DIO，DIO-R和对照组大鼠体重的变化      

　　实验前3组大鼠体重差别无统计学意义（P＞0.05）,实验2周末，喂高脂饲料的大鼠体重开始分化，DIO大鼠体重显著高于对照组和DIO-R组大鼠（P＜0.01），实验12周结束时仍是如此；DIO-R组与对照组大鼠体重差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。表1 3组大鼠分别喂养2周和12周时体重比较(略)注：*与对照组大鼠比较，P＜0.01，△与DIO-R大鼠比较，P＜0.01。

　　2.2 DIO，DIO-R和对照组大鼠NPY蛋白、NPY mRNA阳性面积比较      

　　实验2周末，DIO组大鼠的NPY蛋白阳性面积显著高于对照组大鼠（P＜0.01），NPY mRNA阳性面积高于对照组大鼠（P＜0.05）；DIO组大鼠的NPY蛋白、NPY mRNA阳性面积均高于DIO-R组大鼠（P＜0.05）。见图1，2。

　　2.3 DIO，DIO-R和对照组大鼠NPY蛋白、NPY mRNA积分光密度比较      

　　见表2。表2　3组大鼠喂养2周和12周积分光密度比较(略)注：*与对照组大鼠比较，P＜0.01；△与DIO-R大鼠比较，P＜0.05；△△与DIO-R大鼠比较，P＜0.01。

             
　　实验2周末，DIO组大鼠的NPY蛋白 、NPY mRNA积分光密度显著高于对照组大鼠（P＜0.01）；DIO组大鼠的NPY蛋白积分光密度高于DIO-R组大鼠（P＜0.05），DIO组大鼠的NPY mRNA积分光密度显著高于DIO-R大鼠（P＜0.01）。

　　3 讨论

　　“肥胖抵抗现象”被提出后，已经得到各方面研究的证实，Levin等［4］认为2周时已可划分出DIO和DIO-R大鼠，本实验2周和12周末高脂饲料喂养的大鼠部分体重与对照组相比显著升高，部分与对照组相当，表明DIO和DIO-R模型的建立是成功的。

　　本实验高脂饮食2周末发现，DIO-R大鼠的NPY蛋白和mRNA表达低于DIO大鼠。Lauterio等［5］研究肥胖形成过程中发现2周高脂饮食后，DIO-R大鼠的NPY mRNA表达比DIO大鼠低。Jungao等［6］在研究Sprague-Dawky（SD）大鼠高脂饮食6个月，DIO-R大鼠与DIO大鼠相比，下丘脑NPY mRNA的表达降低了53%。还有研究表明，肥胖抵抗小鼠和肥胖倾向小鼠相比，肥胖抵抗小鼠的NPY mRNA表达较低［7］，本实验结果同上述文献一致。有研究表明，瘦素水平提高是增加能量消耗的代偿反应，同样DIO-R大鼠下丘脑NPY mRNA减少也是一个增加能量消耗、减少脂肪积累的代偿反应。而DIO大鼠NPY mRNA表达较高，可能正因为缺乏有效的增加能量消耗，所以会发生肥胖。这些结果说明高脂饮食引起的NPY mRNA减少可能是DIO-R大鼠抵抗肥胖发生的重要原因之一，同刘荣等［8］的研究一致。本实验还发现高脂饮食12周末，DIO与DIO-R大鼠NPY蛋白和mRNA表达与2周末相比都是下降的，这是DIO大鼠同遗传性肥胖大鼠不同的地方，遗传性肥胖大鼠NPY mRNA水平是持续升高的［9］，说明DIO大鼠在高脂饮食后，改变NPY的表达和抵抗肥胖的能力，但DIO大鼠对NPY代谢调控可能已经不敏感，因为12周末虽然DIO和DIO-R大鼠NPY表达相似，但DIO大鼠体重比DIO-R大鼠高很多。因此DIO-R大鼠NPY mRNA和蛋白减少，且保持对NPY代谢敏感性可能与肥胖抵抗的发生有关，但具体机制有待于进一步研究。

　　参考文献

　　［1］LEVIN BE.Altered sympathetic activity during development of diet-induced in rats. Am J Physiol，1983,244:347-355.

　　［2］施万英,姚兴家,董丹娜,等.饮食性肥胖大鼠血清TNF-α水平探讨.中国公共卫生, 2002,18(5):573-574.

　　［3］LEVIN BE. Arcuate NPY neurons and energy homeostasis in diet-induced obese and resistant rats. Am J Physiol,1999,276(2pt2): 382-387

　　［4］LEVIN BE.Dysregulation of arcuate nucleus preproneurope-ptide Y mRNA in diet-induced obese rats. Am J Physiol,1997,272: 1 365 - 1 370

　　［5］LAUTERIO TJ,DAVIES MJ,DEANGELO M,et al. Neuropeptide Y expression and endogenous leptin concentrations in a dietary model of obesity. Obes Res,1999,7(5):498-505.

　　［6］JUNGAO,LORRAINE G,MARGATET V,et al.Characterization of diet-induced obese rats that develop persistent obesity after 6 months of high-fat followed by 1 month of low-fat diet. Brain Res,2002,936(1-2):87-90.

　　［7］HUGO T,BERGEN,TOORU M,et al. Resistance to diet-induced obesity is associated with increased proopimeanocortin mRNA and decreased neuropeptide Y mRNA in the hypothalamus. Brain Res, 1999,851(1-2):198-203.

　　［8］刘荣,孙长颢,李颖,等.饮食诱导肥胖抵抗和肥胖大鼠血中激素水平的比较．卫生研究, 2003,32(3):212-214.

　　［9］WANG Q,BING C,ALBARAZANJIK,et al. Interactions between leptin and hypothalamic neuropeptide Y neurons in the control food intake and energy homeostasis in the rat.Diabetes,1997，46(3):335-341.

　　【作者单位】 1中国医科大学公共卫生学院儿童少年卫生教研室，沈阳       110001；

　　　　　　　　2 沈阳药科大学；

　　　　　　　　3中国医科大学公共卫生学院社会医学。