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【摘要】 目的 研究核心结合因子（Cbfa1）调控骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为成骨细胞的分子机制。方法 用Perˉcoll密度梯度离心法分离获得人、大鼠和小鼠的MSCs，通过HE、细胞化学、免疫细胞化学、免疫荧光及透射电镜等方法进行鉴定。传代培养后的MSCs分别用重组真核表达载体pcDNA3.1（+）/Cbfal-Ⅱ通过脂质体系统转染，用Northern Blot检测三种成骨细胞特异性细胞外基质蛋白mRNA的表达情况。结果 转染后人、大鼠和小鼠的MSCs都有骨钙素、骨桥接蛋白和Ⅰ型胶原的表达，三者间无明显差别。结论 Cbfa1在转录水平定向调控间充质干细胞分化为成骨细胞，可应用于骨科疾患的基因治疗。
关键词 核心结合因子 骨髓间充质干细胞 成骨细胞 分化
Experimental study on the definitive differentiation from bone marrow mesenchymal stem cells to osteoblast regulated by Cbfal Wang Xiyuan，Wang Yuehui，Ni Jinsong，et al. Jilin University，Changchun130021. 【Abstract】 Objective To investigate the molecular regulation mechanisms of Cbfal to differentiation of mesˉenchymal stem cells（MSCs）to osteoblast.Methods MSCs come from bone marrow of human beings，rats and mice with the method ofPercoll density gradient centrifuging，and MSCs were evaluated with combinationmethods，including HE，cytochemistry，immunochemistry，immunofluorescence analysis and transmission electron microscope.Subcultured MSCs were transfected by recombinant eukaryon expression vector，pcDNA3.1（+）/Cbfal-Ⅱand pCMV5/Cbfal-Ⅲ，under the transfection system of liposomes.Northern Blotwas used to detect the mRNAs of extracellular matrix proˉtein（ECMP）of osteobalst.Results Expression of osteocalcin，osteopontin，typeⅠcollagen mRNAs were detected in transfected MSCs.No significant difference can be found among three different MSCs.ConclusionCbfal can regulate differentiation from MSCs to osteoblast on transcription level，and can be applied to treat orthopedic diseases. Key words core binding factorα1 mesenchymal stem cells osteobalst differentiation 骨髓间充质干细胞（MSCs）具有多分化潜能，在不同调控因子作用下可以向成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等方向分化。其作为组织工程的种子细胞具有明显的优势;通过自体骨髓穿刺即可获得，副损伤轻微;分离筛选简单，培养扩增迅速;应用范围广泛，可体外调控分化为所有中胚层来源的组织;回植体内不会产生组织配型和免疫排斥反应;无肿瘤化倾向;可避免伦理、法律等问题。 MSCs向成骨细胞方向分化受一系列激素、细胞因子和转录因子的调控，其中起决定作用的是核结合因子α1（Cbˉfal），也称成骨细胞特异性因子2（Osf2）。Cbfal可于转录水平使MSCs定向分化为成骨细胞，也可使软骨细胞肥大化，进而促进软骨内化骨，表达骨钙素、骨桥蛋白和Ⅰ型胶原等成骨细胞特异性产物。 Cbfal序列是高度保守的，果蝇、斑马鱼、原鸡、小鼠和人的等位基因中编码区99%同源，表达的蛋白只有几个氨基酸的差异。因此，其他种属的Cbfal经提纯后可应用于治疗人类骨科疑难病症如骨缺损、骨不连、骨发育障碍等。 1 材料与方法 1.1 材料 实验所用C57/B16小鼠和Wistar大鼠由吉林大学动物中心提供，人肋骨取自因非肿瘤性疾患开胸的患者。 1.2 方法 1.2.1 MSCs的分离鉴定 人、大鼠和小鼠的MSCs来源于骨髓冲洗物，用Percoll密度梯度离心法分离，经低血清贴壁培养筛选后，获得克隆细胞，体外大量扩增后，经HE染色、特殊染色、免疫细胞化学、免疫荧光、透射电镜等方法进行鉴定。 1.2.2 真核表达载体pcDNA3.1（+）/Cbfal-Ⅱ的构建 （1）用Trizol法提取C57胎鼠（E16d）成骨细胞的总RNA，以带有HindⅢ和EcoRV酶切位点的引物（上游5′-AAGCTˉTATGGTTAATCT-3′，下游5′-GGCGGCCATATTGA TATC-3′）进行RT-PCR反应。（2）将pcDNA3.1（+）质粒用HindⅢ和EcoRV酶切后与Cbfal-ⅡcDNA连接，重新转化感受态大肠杆菌，提取纯化并行酶切鉴定。（3）重组质粒测序，检测目的片段。 1.2.3 pcDNA3.1（+）/Cbfal-Ⅱ转染MSCs 用pcDNA3.1（+）/Cbfal-Ⅱ转染人、大鼠和小鼠的MSCs，转染体系用Invitrogen公司的Lipofectaminc TM Reagent阳离子交换脂质体介导，比较不同转染条件下的转染效率。 1.2.4 Northern Blot检测 （1）用NEBlot ○R Phototope ○R Kit非放射性试剂盒标记骨钙素、骨质蛋白和Ⅰ型胶原探针。（2）提取转染后MSCs的总RNA，用琼脂糖凝胶电泳分离后，转至带正电荷的尼龙膜上。（3）用标记好的探针与转膜后的RNA杂交。（4）用Phototope ○ R -Star Detection Kit试剂盒进行检测，X-ray曝光显影。 2 结果 2.1 MSCs形态学特征 原代培养的细胞接种24～48h后，可见贴壁细胞，形态为成纤维细胞样细胞，散在生长，分布不均，少部分呈克隆落状，也可见单个细胞存在。胞体呈长梭形，两端有长突起，胞质内颗粒较多，折光性差，核不清楚。经过3～5天的生长潜伏期后，进入对数生长期，在第7天时，形成明显克隆，细胞形态更加清晰，核明显可见，并有1～2个核仁。第10～12天时，细胞已基本汇流贴满培养孔板底部，细胞变得扁平，胞体狭长，呈鱼群样、漩涡状、辐射状或网状排列。透射电镜检测见细胞表面有许多微绒毛，其分布主要位于胞体一侧。细胞核较大，有切迹，不规则;核仁明显，个别细胞见2～3个核仁，核内常染色质丰富，可见双层核膜，核周围间隙清晰。胞质均匀，胞浆内细胞器丰富，线粒体、粗面型内质网、高尔基体、溶酶体较多，并可见大量的糖原，融合形成糖原池;部分内质网可见轻度扩张，提示细胞功能旺盛。未见纤维丝，表明细胞为较幼稚的细胞。 2.2 细胞化学 所有MSCs过碘酸雪夫氏（PAS）染色均为阳性，胞浆内出现鲜紫红色均匀颗粒，细胞核浅蓝色，提示骨髓间充质干细胞富含糖类物质。苏丹黑B染色后细胞中未见黑色颗粒，提示骨髓间充质干细胞缺乏脂肪成分。 2.3 免疫细胞化学 人MSCs的CD29、CD44表达阳性、造血细胞、内皮细胞、软骨细胞标志，CD34、CD45阴性。 2.4 免疫荧光染色 一抗用鼠抗人CD29单克隆抗体和鼠体人CD44单克隆抗体，二抗用羊抗鼠IgG-FITC。用激光共聚焦显微镜（FV500）在488nm处进行激发，胞浆内出现绿色荧光，分布均匀，胞核不着色。 2.5 重组pcDNA3.1（+）/Cbfal-Ⅱ质粒的鉴定 用HindⅢ和EcoRV酶切后电泳，获得两条片段，大小分别约为5.5kb和1.7kb，与目的基因相符。测序结果表明RT-PCR产物序列与Genebank发表的Cbfal-Ⅱ序列一致，说明连接成功。 2.6 Northern Blot 杂交结果显示pcDNA3.1（+）/Cbfal-Ⅱ转染人、大鼠和小鼠的MSCs后，都有骨钙素、骨桥接蛋白和Ⅰ型胶原mRNA的表达，X-ray底片曝光后通过图像分析系统比较杂交斑点的灰度值，发现三者间无明显差异。 3 讨论 骨髓间充质干细胞（MSCs）是一种成体干细胞，具有多分化潜能和自我复制功能。在正常情况下，MSCs数量很少，保持正常的核型和端粒酶活性，不能自发分化或产生完整的个体。在特定条件下，它可以分化成不同的中胚层细胞，形成多种组织和器官 ［1，2］ 。MSCs的最大应用前景是体外培养组织工程骨及软骨，自体移植解决各种骨科疑难病症，如骨不连、骨缺损、关节软骨缺损、骨关节炎等的修复治疗。作为骨组织工程的重要种子细胞，MSCs具有来源广泛、易于培养、使用方便等优势，其生物性能稳定，可于体外多次传代扩增，并保持旺盛功能。研究表明，无论是在骨骼发生阶段，还是发育阶段，MSCs的数量和功能都是维持骨骼正常生理机能的决定性因素。在各种病理状态下，MSCs 向成骨细胞分化的能力出现变化，进而影响骨骼的代谢 ［3，4］ 。因此深入研究其生物学特性，探索体外诱导条件的调控和优化对于加速骨组织工程的临床应用进程是非常重要的。我们选择不同种属的MSCs进行培养，联合应用HE、细胞化学、免疫细胞化学、免疫荧光、透射电镜等方法进行鉴定，证实经密度梯度离心法获得的MSCs具有干细胞特征，也进一步证明密度梯度离心法是获得MSCs的可靠的方法。 Cbfal是成骨细胞（osteoblast，OB）特异表达的、最早和最明确的、决定OB分化的因子，它所指导的OB分化途径是不可替代的 ［5］ ，Cbfa