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【摘要】 目的 研究多囊卵巢综合征（PCOS）脂肪组织肿瘤坏死因子受体Ⅱ（TNFR2）mRNA的表达，从分子水平探讨PCOS患者发生胰岛素抵抗（IR）的分子生物学机制。方法 采用RT-PCR技术结合内对照，半定量检测PCOS及其对照组脂肪组织TNFR2mRNA的表达。结果 TNFR2mRNA的表达量在PCOS肥胖组（0.90±0.12，P<0.001）和PCOS非肥胖组（0.62±0.14，P<0.05）均显著大于非肥胖对照组（0.50±0.15），且以PCOS肥胖组升高更为明显（P<0.001），PCOS肥胖组与肥胖对照组（0.88±0.14）相比则差异无显著性（P>0.05）。结论 PCOS两组脂肪组织TNFR2mRNA的表达均较非肥胖对照组增强，且以PCOS肥胖组升高更为明显，高水平的肿瘤坏死因子α（TNFα）可能通过上调TNFR2促进PCOS者TNFα系统活性增强。
关键词 多囊卵巢综合征 胰岛素抵抗 肿瘤坏死因子受体Ⅱ mRNA 肿瘤坏死因子α
A study on the expression of TNFR2mRNA in adipose tissue in PCOS Wang Zhuchen，Gu Xiongfei，Yang Dongzi，et al. Department of Obstetrics and Gynecology，Shenzhen Second People’s Hospital，Shenzhen518035. 【Abstract】 Objective We study the expression of TNFR2mRNA in adipose tissue from PCOS to get insight into the mechanism of IR in PCOS at the molecular biological level.Methods We survey the expression of TNFR2mRNA in adipose tissue by semi-quantitative RT-PCR technique with inner-control.Results The expression of TNFR2mRNA inadipose from the obese PCOS group（0.90±0.12，P<0.001）and the nonobese PCOS group（0.62±0.14，P<0.05）is markedly higher than the nonobese control group（0.50±0.15），and the obese PCOS group presents more increase（P<0.001）.The difference between the obese PCOS group and the obese control group（0.88±0.14）is of no statistically significance（P>0.05）.Conclusion These results suggest that the expression of TNˉFR2mRNA in adipose tissue from PCOS patient isabnormally excessive.The high TNFαcould up-regulate TNFR2which amplified the activity of TNFαin PCOS women. Key words polycystic ovary syndrome adipose tissue insulin resistance tumor necrosis factor receptorⅡmRNA tumor necrosis factor alpha 多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）是以高雄激素血症和不排卵为特点的一组综合征。目前认为PCOS是以胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）为特征的内分泌代谢疾患，继发于IR的高胰岛素血症对造成高雄激素征象起着重要作用 ［1］ 。肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor alpha，TNFα）是一个具有广泛生物活性的多肽，近年来大量的研究结果提示，TNFα还可能是IR的重要发病机制之一。在肥胖的人和鼠，增多的TNFα选择性地上调了肿瘤坏死因子受体Ⅱ（Tumor Necrosis Factor ReceptorⅡ，TNFR2），且TNFα和TNFR2mRNA水平与IR呈正相关 ［2］ 。Fernandez-Real ［3］ 等报道肥胖患者血TNFR2水平较TNFα升高更为明显，并与ISI呈负相关，可作为肥胖患者TNFα相关IR的预测指标。为探讨TNFR2与PCOS患者IR的发病关系，我们对PCOS脂肪组织TNFR2mRNA的表达进行了研究，现报告如下。 1 资料与方法 1.1 实验对象与组织来源 收集妇科病房2000年3月～2001年7月PCOS患者24例，临床症状及内分泌检查均符合PCOS诊断，术后病理检查证实为多囊卵巢。诊断标准是:（1）月经稀发或闭经和（或）多毛，肥胖;（2）不孕或持续基础体温（BBT）单相;（3）血清LH异常高，LH/FSH>2～3和/或高雄激素血症;（4）B型超声检查证实有卵巢多囊改变，表现为卵巢增大，包膜回声增强，可见单侧卵巢泡数≥10个，直径2～8mm，围绕卵巢边缘，有时散在分布于卵巢内 ［4］ 。24例PCOS患者据体重指数［体重/身高（kg/m 2 ）］分为肥胖组（体重指数>24kg/m 2 ）和非肥胖组（体重指数<24kg/m 2 ）各12例;另随机收集妇科病房诊为卵巢囊肿或输卵管阻塞行开腹手术的肥胖和非肥胖妇女各12例。上述各组均无其它急慢性疾病。术中开腹时切取皮下脂肪组织适量，迅速置液氮中冻存。4组的临床资料见表1。由表1可知，PCOS两组分别与其体重相匹配的对照组相比，年龄和BMI均无统计学差异。 1.2 主要试剂及仪器 TRIzoe Reagent（Gibco）;Titan One Tube RT-PCR kit（Roche）;PCR Marker（TakaRa DL2000DNA Marker）;焦碳酸二乙酯（DEPC）（AMRESCO）;DNA上样缓冲液（TakaRa）;氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为新开瓶国产分析纯试剂:Tip头和EP管等均经DEPC处理，除去RNA酶污染;有关其它物品也经高温干烤灭活RNA酶。RNA样品缓冲液（250μl甲酰胺，83μl37%甲醛，50μl10×MOPS缓冲液，0.01%溴酚蓝）;10×TBE贮存液（108g Tris碱，55g硼酸，40μl0.5μmol/L EDTA（pH0.8）加DEPC处理水至1L）。10×MOPS（0.2mol/L，3-CN-吗啉代）-丙磺酸（MOPS），50mmol/L乙酸钠，10mmol/L EDTA（pH7.6）。主要仪器有PCR扩增仪（Hema480）;凝胶成像分析系统（UVP-GDS8000），低温离心机（HARRIS）;DNA/蛋白分析仪（Beckman DU530）。 表1 各组的临床资料 （ˉx±s） 1.3 方法 ［5］ 1.3.1 脂肪组织总RNA的提取及鉴定 （1）取出液氮冻存的脂肪组织1g，加入5ml TRIzol，电动匀浆，12000g低温离心10min，吸出清亮的均一水相部分至另一离心管中，室温孵育5min;（2）加入1ml氯仿，剧烈振摇15s，室温静置3min，12000g低温离心15min;（3）小心吸取上层无色水相至另一离心管中，加入2.5ml异丙醇，混匀，室温静置10min，12000g低温离心10min;（4）小心弃掉上清，加75%乙醇5ml，振匀，洗涤RNA沉淀，7500g低温离心5min，弃去上清，沉淀经空气干燥1min，溶于适量DEPC处理水中;（5）DNA/蛋白质分析仪确定每次样品中A260/280比率大于1.8，并测定所抽提总RNA的浓度，DEPC处理水将各样品总RNA配制成0.5μg/μl，分装后置-70℃保存备用。（6）RNA变性电泳:取17μl RNA样品加3μl RNA样品缓冲液，65℃变性15min，冰浴中冷却后上样，1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶（1.5g琼脂糖，10ml10×MOPS，73ml DEPC处理水→微波炉化胶后冷却至60℃，加17ml37%甲醛，5μl EB→倒板制胶）70V电泳，电泳道1和泳道2的上样量分别为15μl和5μl缓冲液为1×MOPS，观察RNA的完整性。 1.3.2 引物设计及建立内对照 TNFR2和β-actin引物均由上海生工合成。（1）TNFR2引物序列:上游引物5′（591）ACGTTCTCCAACACGACTTCATC（613）3′;下游引物5′（940）ATGATGACACAGTTCACCACTCC（918）3′;预扩增片断为349bp。（2）β-actin引物序列:上游引物5′（74）ATGGATˉGATGATATCGCCGCGCT（96）3′;下游引物5′（723）CACAGCTTCTCCTTAATGTCACG（701）3′;预扩增片断为649bp。引物设计均采用有关核酸序列分析软件计算机辅助设计。经对人类基因库扫描检查未发现其它同源序列。 1.3.3 反转录-多聚酶链反应（RT-PCR）（1）RT-PCR反应体系:混合物1，H 2 O4.5μl，dNTP4μl，DTT solution2.5μl，RNase inhibitor1μl，TNFR2up