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【摘要】 目的 利用聚合酶链反应（PCR）进行HLA-B27的测定，探讨HLA-B27水平，正确评价HLA-B27的临床意义。方法 应用PCR技术进行人外周血白细胞的HLA-B27检测。结果采用该方法对各组病人外周血HLA-B27测定。结果表明:正常对照组，健康人70例，B27阳性3例，阳性率4.2%，48例原因不明的腰腿痛病人中B27阳性11例，阳性率22.8%，本组临床拟诊强直性脊柱炎（AS）患者70例，阳性58例，阳性率82.8%。本组6例混合性脊椎炎患者B27全为阳性。结论 从实验结果来看，AS患者携带率明显高于正常人（P<0.05），揭示HLA-B27等位基因与AS的发生呈强相关 ［1］ 。该基因的检测对AS的诊断有一定的参考价值，对于临床诊断与鉴别诊断AS的发生有重要的帮助。
关键词 HLA-B27 强直性脊柱炎 PE9700扩增仪
HLA-B27抗原为HLA I类抗原，存在于所有核细胞和红细胞表面，能刺激产生同种抗体并控制细胞毒T效应细胞的特异性。HLA位点具有众多的等位基因，造成HLA的极端多态性。它代表一个家族包括几个紧密相关的等位基因（B2701-11） ［1］ 都具有密码子AAG、编码赖氨酸70（LYS）。近年来，由于分子生物学的进步，人们对B27包括其亚型的分子结构、种群分布以及B27亚型与AS的关系有更深一步的认识。资料表明95%的AS患者具有HLA-B27抗源，具有HLA-B27抗源者其患AS的几率为7.3% ［2］ 。因而，HLA-B27测定成为临床AS诊断与鉴别诊断的主要手段。本文拟建立一种PCR-SSP分子生物学检测技术，探讨HLA-B27的表达水平。我们对门诊骨科及住院骨科、内分泌科共124例患者，利用PCR-SSP技术，进行HLA-B27检测，现报告如下。 1 材料与方法 1.1 检测对象 全部为本院门诊和住院共124例患者，其中临床诊断AS70例（男64例，女6例），平均年龄29岁;不明原因腰腿痛48例，男38例，女12例，平均年龄为25岁;混合性脊椎炎6例，平均年龄28岁。对照组70例为健康供血员，男60例，女10例，平均年龄28例。 1.2 实验室检查 1.2.1 标本的采集 检测当日清晨采集静脉血液1.5ml，注入含有EDTA干燥抗凝血管内充分混匀（不得有凝块）。 1.2.2 主要试剂与仪器 TaqDNA聚合酶、特异性引物、标准PCRBuffer，DNA模板（由北京帕弗瑞生物技术有限公司提供）、PCR扩增仪（美国PE9700型）、紫外透射仪Uv-Iv（北京新技术应用研究所）。 1.3 方法 1.3.1 DNA的提取检测 取上述已抗凝混合匀的血液标本500μl放进1.5ml反应试管中，加700μl的ELB溶液，然后混合均匀（用吸管反复吸挤）。用低渗溶血法分离白细胞，再用高氯酸盐沉淀法提取外用白细胞DNA。分离出的DNA可以被溶解于水或DNA溶液缓冲液（如TE缓冲液），整个提取过程大约需45～60min，主要取决于样本量的多少。DNA能在2℃～8℃条件下贮存几个月，在-20℃条件下，储存更长时间。 1.3.2 PCR扩增 反应体系（13μl），Pel-Freez标准PCRBuffer6μl;特异性引物5μl，Taq DNA聚合酶0.08μl，ddH 2 O1.02μl;模板DNA0.9μl。PCR扩增96℃预变性1min，然后96℃25s，70℃50s，72℃45s，进行30个循环周期，整个循环需65min，Hold4℃，扩增110min，取13μl扩增产物加2μl上样缓冲液置2%琼脂糖凝胶上电泳。 1.4 统计学方法 采用SPSS统计软件对结果进行χ 2 检验。 2 结果 PCR扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳结果，70例AS患者中58例出现260bp的扩增条带，片断大小与设计的目的基因片段相同，为HLA-B27阳性结果，阳性率为82.8%，对照组3例，阳性率为4.2%，两组间差异有显著性（χ 2 =5.45，P<0.05），与文献报道一致 ［3］ 6例混合性脊椎炎，全为阳性;原因不明的腰腿痛48例HLA-B27阳性者有11例，占22.8%，从统计学分析看，AS患者B27携带率明显高于正常人（P<0.05），揭示HLA-B27等位基因与AS的发生呈强相关 ［3］ 。大量不典型AS通过B27检测而证实B27检测为有价值的诊断工具。 3 讨论 实验所用B27试剂盒包括3个反应孔，其中2个为特异性反应孔（1、2号管），另一个为污染监控孔3号管，两个特异性反应孔引物编号分别为PM138B（1号管）和PM053B（2号管）。PM138B孔的阳性产物大小约为600bp左右;PM053B孔的阳性产物可能出现2条带，一条大小约为600bp左右，另一条大小为200bp左右。只要出现一条阳性带即可判断此孔为阳性反应孔，两个特异性反应孔均为阳性，而污染盐护孔阴性者，即可判断其B27型。本文AS患者58例出现260bp的扩增条带，片段大小与设计的目的基因片段相同，为B27阳性结果，阳性率达82.8%，与文献报道一致 ［4］ 。混合性脊椎炎是一种以强直性脊椎炎伴有四肢关节炎的疾病，本文6例HLA-B27全为阳性，对临床诊断与鉴别诊断意义很大。对照组70例3例HLA-B27阳性，阳性率4.2%，与中国人HLA-B27频率为3.4%一致，强直性脊椎炎发病率为0.26% ［4］ ，具有HLA-B27抗原者其患AS的几率为7.3%，该基因的检测与AS的诊断有一定的诊断价值。 HLA-B引物混合物含有扩增1069bp片段的编码，人生长因子的对照引物。这些引物的浓度大约是特性等位基因引物对的1/5，目的是为成功的PCR扩增反应提供一个内部对照，这种扩增常发生。例如:在特性等位基因或基因组PCR片段存在或缺失的情况下发生扩增反应。因此，在PCR反应中一般能看到对照带。偶而在特性等位基因HLA-B PCR产物存在下，对照组出现或消失，这不是局限性，因为特定的带为成功PCR程序提供检查。被PCR拟制剂污染的DNA，诸如血红蛋白、肝素、乙醇等能严重干扰PCR反应，因此，肝素不应作为DNA分离原料，因使用EDTA或柠檬酸抗凝。强直性脊柱炎是当前一种常见病、多发病，以侵犯骶骨关节、脊柱等活动较差的大关节为主，致残率高。过去一致把AS病与类风湿关节炎（RA）相混肴，或称为“类风湿关节中枢型” ［5］ ;误诊率高达60%，X线检查只能提示AS病的中晚期炎症改变，难以确定炎症性质，因而延误治疗时机。对AS病早期确诊，及时治疗至关重要，使远期预后良好。所以，对有上述症状患者作HLA-B27检测可早诊断、早治疗，以免致残。根据BERRETTONT公式可计算出带来有B27抗原与不带有B27抗原时诊断AS的概率。见表1。 表1 诊断AS的概率 如:临床医生根据其它检测，估计病人患AS的几率为50%时，如B27阳性，患AS的概率为96.54%，如B27为阴性，患AS的概率为4.92%。 参考文献 1 Msrsh SGE:Tissue Antigen1997，50:207. 2 甘茂周，HLA-B27亚型及其与强直性脊柱炎的关系.国外医学·输血及血液学分册，1999，22（3）:163-165. 3 孙倩，兰炯采.脐血中HLA表达与分型.国外医学·输血及血液学分册，1998，22（3）:156. 4 甘茂周，HLA相关疾病的分子基础.输血及血液学分册，1998，22（5）:227-301. 5 王申五.基因诊断技术.北京:北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1992，36. 作者单位:476100河南省商丘市第一人民医院输血科 （收稿日期:2003-11-20） （编辑海 涛）