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【摘要】 目的 探讨RANTES基因启动子区-28C/G多态性与中国昆明地区汉族人糖尿病肾病（DN）的相关关系。方法 运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，在中国昆明地区汉族人中对178例2型糖尿病患者（其中正常白蛋白尿即DN0组58例，微量白蛋白尿即DN1组70例，大量白蛋白尿即DN2组50例）和67例健康对照者的RANTES基因启动子区-28C/G多态性进行检测，并比较分析各组间基因型频率和等位基因频率以及相关临床资料。结果 （1）RANTES启动子区-28G等位基因频率在NC、DN0、DN1及DN2组中分别为6%、7.8%、8.6%和8.6%，各组间基因型频率和等位基因频率差异均无显著性（P>0.05）。（2）DN2组的年龄和WHR高于DN0组，空腹胰岛素水平高于DN1，DN2组的病程和SBP高于DN0和DN1组，均具有统计学意义。结论 在中国昆明地区汉族人中，RANTES基因启动子区-28C/G多态性可能与DN不相关。
关键词 糖尿病 遗传学 RANTES基因 糖尿病肾病
RANTES gene promoter region-28C/G polymorphism and diabetic
nephropathy intype2diabetes mellitus
Li Huifang，Song Dianping，Zhang Min，et al.
The Diabetes Department of First Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming650032.
【Abstract】 Objective To investigate the associatoin of RANTES gene promoter region-28C/G polymorˉphism with diabetic nephropathy.Methods The polymorphism of RANTES gene promoter-28C-G in178unrelatˉed Kunming Han race type2diabetes（including58normal albuminuria DN0group，70microalbuminuria DN1group and50macroalbuminuria DN2group）and67normal control were detected by polymerase chain reaction-ristriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）.The genotype frquency and allele frequency and relative clinical data were compared between groups.Results （1）Allele frequence of RANTES promoter-28G was6%、7.8%、8.6%and8.6%，therewere no statistical difference in genotype and allele frequencies between groups.（2）The age and waist-hip ratio（WHR）in DN2were higher than DN0，the level of fasting insulin systolic in DN2were higher than DN1，systolic blood pressure（SBP）and diabetes duration in DN2were higher the DN0and DN1，there were statistical in these differences.Conclusion The RANTES gene promoter region-28C/G polymorphism may not be associated with the occurrence and the development of the diabetic nephropathy in Kunming Han race Chinese. Key words diabetes mellitus genetics RANTES gene diabetic nephropathy
糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）患者的主要微血管并发症，其发生除与血糖、血脂、血压等控制不良有关外，还可能与遗传有关。近年来趋化因子在DN发生过程中的作用越来越受到重视，国外有文献报道C-C类趋化因子RANTES（regulated on activation，normal T-cell expressed and secreted）启动子区-28G阳性基因型与DN的发生有关 ［1］ 。我们就此多态性进行检测，旨在探讨中国昆明地区汉族人DN是否与RANTES-28C/G多态性存在关联。
1 对象与方法
1.1 研究对象 DM组:根据1999年WHO诊断标准诊断为2型糖尿病的患者178例，排除其他可能导致蛋白尿的因素和肾脏疾病后，依尿白蛋白（UAlb）定量分为DN0组（UAlb<30mg/24h）、DN1组（30mg/24h≤UAlb<300mg/24h）和DN2组（UAlb≥300mg/24h）。DN0组58例（男29例，女29例），年龄（51.67±15.68）岁;DN1组70例（男38例，女32 例），年龄（55.49±13.22）岁;DN2组50例（男27例，女23例），年龄（59.28±13.33）岁。正常对照组（NC）:无糖尿病、高血压家族史的健康对照者67例（男37例，女30例），年龄平均（42.6±5.22）岁。
1.2 方法
1.2.1 RANTES启动子区-28C/G多态性检测 采用标准的酚/氯仿法抽提人外周血白细胞DNA作为模板。以寡核甘酸引物5′-ACA GAG ACT CGA ATTTCC GGA-3′为上游序列，5′-CCA CGT GCT GTC TTG ATC CTC-3′为下游序列（上海生工生物工程公司）。PCR体系:模板1μl，其余组份的最终浓度分别为dNTP167μmol/L，引物（一对）0.7μmol/L，Taq DNA聚合酶1.5U，10倍反应缓冲液3μl，镁离子1.5mmol/L，加双蒸水至30μl。PCR反应条件:94℃预变性5min，然后94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共35次循环，终末延伸72℃5min。在美国P.E9600基因扩增仪中进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳证实后，以限制性内切酶Mnl I（MBI）进行消化（37℃，10h）。消化产物经6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（100V电压电泳50min）及溴化乙锭染色后GelDoc1000图象分析系统观察结果（见图1），因20bp和27bp的片段太小电泳结果不能看到，根据146bp和126bp两条条带判断基因型结果。C/C基因型有126bp、20bp和27bp三条片段;C/G基因型有146bp、126bp、20bp和27bp四条片段，G/G基因型有146bp和27bp两条片段。
图1略
1.2.2 临床及生化指标检测 全自动生化分析仪检测血糖、血脂，用放免法检测空腹及餐后2h胰岛素和C肽水平，用微柱法测HbA 1c 含量，测量身高、体重、腰围、臀围并计算体重指数（BMI）和腰臀比（WHR）。
1.3 统计学方法 临床变量以（ˉx±s）表示。组间比较用方差分析，各组间基因型频率和等位基因频率比较用χ 2 检验（SAS软件），并按Hardy-Weinberg平衡原理确定样本的群体代表性。
2 结果
2.1 各组间基因型和等位基因频率比较 由表1可见:RANTES启动子区-28G等位基因频率在NC、DN0、DN1及DN2组中分别为6%、7.8%、8.6%和8.6%，各组间基因型频率和等位基因频率差异均无显著性（P>0.05）。
表1 各组RANTES基因型频率和等位基因频率略
2.2 DM组中各临床及生化指标的比较 由表2可见:DN2组的年龄和WHR高于DN0组，空腹胰岛素水平高于DN1，糖尿病病程和SBP高于DN0和DN1，均具有统计学意义（P<0.05），其余指标差异无显著性（P>0.05）。
表2 DM组中临床资料比较 （略）
3 讨论
DN的发生与多种因素有关，近来趋化因子在DN中的作用引起研究者的极大重视。趋动因子是一类结构相似、分子量约8～10kD、具有趋动功能的细胞因子，主要由肾小球系膜细胞表达和分泌，据分子中半胱氨酸残基的相对位置分为四个家族:C-X-C族、C-C族、C族和CXXXC族，RANTES属C-C族 ［2］ 。已有报道在链脲佐菌素诱导的DM大鼠模型的肾组织和DN患者的肾活检标本中发现单核细胞/巨噬细胞的浸润，提示DM患者趋化因子产生增加，而且单核细胞在肾组织的浸润和向巨噬细胞的分化可能与DN的发生或发展有关 ［1，3，4］ 。可能的机制为:（1）DM状态通过PKC激活、氧化应激和糖化终产物的形成促进细胞因子如TNF-α、IL-β的产生，二者促进人类系膜细胞表达和分泌趋化因子RANTES［5］ ，RANTES受体CCR5主要在单核细胞/巨噬细胞表面表达，因此RANTES与其受体的相互作用可能促进单核细胞向肾小球的浸润、分化和活化 ［6］ 。Kuˉnihiro等 ［6］ 报道在日本人中RANTES启动子区-28G阳性基因型与DN的发生有关，且-28G等位基因携带者的RANTES表达增加 ［6］ 。我们的研究发现:RANTES启动子区-28位基因型频率和等位基因频率在正常对照（NC）DN0组、DN1组及DN2组间均无统计学差异，说明RANTES基因启动子区-28C/G多态性可能与中国昆明地区汉族人DN不相关，造成这种差异的原因可能与种族差异有关。我们的研究发现在中国昆明地区的2型糖尿病患者中RANTES启动子区-28G等位基因频率为8.4%，Kunihiro等 ［6］ 报道日本的2型糖尿病患者中RANTES启动子区-28G等位基因频率为13%，相关的报道在其他人群中尚未见报道，所以也可能由于样本量太小很难得到阳性结果，仍有必要扩大样本进一步研究。
参考文献
1 Nakajima K，Tanaka Y，Nomiyama T，et al.Chemokine receptor genotype is associated with diabetic nephropathy in Japanese with type2diabetes.Diabetes，2002，51:238-242.
2 Luster AD.Chemokines-chemotactic cytokines that mediate inflammaˉtion.N Engl J Med，1998，338:436.
3 Sassy-Prigent C，Heudes D，Mandet C，et al.Early glomerular macrophage recruitment in streptozotoein-induced diabetic rats.Diaˉbetes，2000，49:466-475.
4 Reape TJ，Groot PH.Chemokines and atherosclerosis.Atherosclerosis，1999，147:213-225.
5 Wolf G，Aberle S，Thaiss