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首页合作平台在线期刊中华现代临床医学杂志2004年第2卷第5B期

全脑缺血再灌注小鼠中枢神经系统损伤的病理研究

来源:中华现代临床医学杂志
摘要:【摘要】目的探讨全脑缺血再灌流小鼠中枢神经细胞损伤。方法采用重复阻断小鼠双侧颈总动脉并尾部放血(放血量小于体重的6%)再灌流的方式,建立小鼠卒中模型。在此模型基础上,采用病理学技术,对脑缺血再灌注后小鼠额叶,海马区脑组织形态变化进行观察。结果重复缺血再灌注1天神经细胞间质水肿,胞核浓染,固缩,再......

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 【摘要】 目的 探讨全脑缺血再灌流小鼠中枢神经细胞损伤。方法 采用重复阻断小鼠双侧颈总动脉并尾部放血(放血量小于体重的6%)再灌流的方式,建立小鼠卒中模型。在此模型基础上,采用病理学技术,对脑缺血再灌注后小鼠额叶,海马区脑组织形态变化进行观察。结果 重复缺血再灌注1天神经细胞间质水肿,胞核浓染,固缩,再灌注3天,额叶皮层少量胶质细胞增生;海马可见颗粒细胞呈空泡样变性。缺血再灌流7天,皮层多量的小胶质细胞增生聚集成堆;海马CA 1 区锥体细胞变性,且部分坏死。缺血再灌流28天,皮层神经细胞明显减少;海马CA 1 、CA 3 区锥体细胞大量缺失、变性、坏死,齿状回颗粒细胞变性呈空泡样。结论 脑缺血再灌流中存在迟发性神经元死亡。

关键词 动物模型 缺血再灌流 迟发性神经元死亡

Pathological research in CNS damage after repetitive ischemia-refusion of rat

Sun Boqian Wang Hongyan,Li Wei,et al.

Affiliated Hospital of Medical College of Beihua University,Jilin132011.

【Abstract】 Objective To explore of structure change of frontal cortex and hippocampus histology wth repetiˉtive ischemia-refusion.Methods To adopt repetitive ischemia-refusion established rats model.Results There is delayed neuronal death(DND)in brain of rats wth repetitive ischemia-refusion and more severe follow duration of repetitive ischemia-refusion.Conclusion This research demonstrate DND exist in repetitive ischemia-refusion.

Key words animal model ischemia-refusion delayed neuronal death

脑缺血后脑组织形态的长期慢性改变是近年来人们非常关注的问题,它直接影响到临床救治和康复。我们建立了小鼠卒中模型,采用病理学技术,分别对脑缺血再灌流后不同时间小鼠额叶、海马组织形态变化进行检测,为进一步研究脑缺血再灌流损伤提供依据和手段。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物全部采用由白求恩医科大学实验动物中心提供的雄性昆明小鼠6~7周龄,体重25~28g。超薄切片机(LKB-Ⅱ),OLYMPUS显微镜(日本)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 假手术组5只作为对照组,缺血再灌流组,根据再灌不同时间提取标本并分7组,即:术后1h、1、3、7天、2、4、6周、每小组5只,共35只。

1.2.2 动物模型制备 用12%乌拉坦按1.0g/kg,腹腔注射麻醉后,将小鼠仰卧固定,经颈正中切口,分离双侧颈动脉并套以“0”号丝线,将双侧颈动脉同时结扎阻断并确定无血流通过后,30min后切断丝线灌流10min,再次阻断30min后,放开线,使血流再通。阻断的同时,在距尾尖1.5cm处剪断放血,放血量小于体重的6%,以造成全脑低灌流,放血后热凝止血。术毕腹腔注射生理盐水1ml。假手术组:麻醉及手术和实验过程与缺血再灌组完全相同,但不阻断颈总动脉亦不放血。各组动物分别于术后1h、1、3、7天、2、4、6周采取标本。方法是采用断头处死,取额叶皮层和海马区,根据不同检验目的而制成标本。

1.2.3 动物模型评价标准及检测方法 采用卒中指数评分和神经病学症状评分标准。卒中指数评分:总分25分,0 ~3分为症状组,3~9分为中间组,可能有损伤,>10分明显有损伤。毛发脏乱颤抖:1分,运动减少或迟钝:1分,耳触觉迟钝:3分,头翘起:3分,后肢外展呈“八”字:3分,上睑下垂:1分,转圈:3分,惊厥或爆发运动:3分,极度衰弱:6分。神经病学症状评分标准:总分10分,0分正常,1~3分轻度损伤,4~6分中度损伤,7~10分严重损伤。有自发探究:0分,刺激时能走动:1分,正常步态:0分,共济失调:1分,爬行:2分,无步态:3分,能进食:0分,不能进食:1分,能饮水:0分,不能饮水:1分,疼痛刺激可移动:0分,仅头或躯干运动:1分,肢体回缩或无反应,2分。

1.2.4 病理标本制备

1.2.4.1 常规HE染色、尼氏染色 将各组小鼠按缺血不同时间断头取脑,10%福尔马林固定,24h后取出整个脑自额极至枕叶分A、B、C、D、E5等分,冠状切片取A、C、D脑片,常规脱水、透明、HE染色、尼氏染色。

1.2.4.2 电镜 缺血再灌不同时间小鼠断头处死,取额叶,海马组织1mm 3 于4%戊二醛PBS作预固定,1%锇酸后固定,梯度酒精脱水,Epon812环氧树脂包埋,制备半薄切片定位后,超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色,以备电镜观察。

2 实验结果

2.1 动物模型卒中指数及神经病学症状评价 我们对重复缺血30min(二次缺血中间再灌注10min)再灌注不同时间(1、3、7、14、28、42天)小鼠的卒中指数,神经病学症状进行了评定,卒中指数总分为25分,0~3分为症状组,3~9分为中间组,可能有损伤,大于10分,明显有损伤。神经病学症状评分总分10分,0分正常,1~3分轻度损伤,4~6分中度损伤,7~10分严重损伤。评分结果显示:再灌流1天,评分较对照组3.5±0.53,4.6±0.54,明显提高,其主要表现为运动减少,不能进食,反应迟钝,部分小鼠共济失调,转圈,后肢呈“八”字,眼睑下垂,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。再灌流3天后,除个别眼睑下垂,后肢呈现“八”字,轻度转圈外,饮食水,运动基本接近正常。随再灌流时间的延长,上两项评分均接近于正常对照组,运动障碍完全恢复。至再灌流28天后,又出现反应迟钝,活动减少,但全面测定卒中指数与神经病学症状均为0~3分之间,为正常范围。见表1。

表1 小鼠卒中指数与神经病学评分

注:t检验 ˇ P<0.05vs control

2.2 重复缺血再灌注不同时间小鼠病理形态学超微结构改变

2.2.1 光镜下病理改变 常规HE染色、尼氏染色对照组大脑皮层,海马区神经细胞形态及分布未见异常。重复缺血再灌注1天神经细胞间质水肿,神经细胞核浓染,固缩,顶树突延长,海马区轻度缺血改变,再灌注3天额叶皮层少量胶质细胞增生,海马区可见颗粒细胞变性呈空泡样。缺血再灌注7天,皮层多量的小胶质细胞增生聚集成堆;海马CA 1 区锥体细胞变性,部分坏死。缺血再灌流2周,皮层胶质细胞聚集成堆;海马CA 1 、CA 2 区锥体细胞坏死增多。缺血再灌注28天,皮层神经细胞明显减少,代之大量胶质细胞增生,多处聚集成堆;海马CA 1 、CA 3 区锥体细胞大量缺失、变性、坏死,齿状回颗粒细胞变性成空泡样,见图1、2。图1 再灌流1天,小鼠皮层锥体细胞核固缩尼氏染色40×综上所述,重复缺血再灌注早期神经细胞间质水肿,锥体细胞变性,细胞核固缩,随着再灌注时间的延长,额叶皮层神经细胞数量逐渐减少代之胶质细胞增生聚集成堆,出现海马区锥体细胞变性坏死。

2.2.2 电镜超微结构改变 对照组额叶皮层及海马区神经细胞核呈圆形,核膜双层结构清楚,核内染色质分布均匀,可见核孔、单个或多个核仁。细胞浆无水肿,细胞质可见完整的细胞器,排列有序。线粒体大小,形态正常,内嵴清晰可见,基质均匀,粗面内质网散在分布,表面均匀分布着核蛋白体,高尔基器规则排列分布于核周,树突可见,分布均匀有序密集排列的微管与树突长轴平行。胶质细胞核圆,核内染色质分布均匀。缺血再灌注后神经细胞出现变性坏死。核膜不规整、凹陷染色质聚集、细胞核基质肿胀、破坏,排列紊乱,有空泡形成,粗面内质网扩张,线粒体肿胀,嵴消失,形成空泡,小胶质细胞凝聚,可见变形。见图3。 图2 再灌流2周,小鼠海马CA 2 区锥体细胞变性,核固缩尼氏染色40×图3 再灌流小鼠神经细胞核膜不规整,凹陷,染色质聚集、电镜低倍3 讨论神经系统的细胞死亡可通过多种机制发生,并已被描述为坏死与凋亡两种不同的方式,分别涉及被动和主动机制 [1] 。脑组织长时间缺血后发生梗死时出现神经元和胶质细胞的快速死亡(数分钟至数小时),而缺血中心区周围则为一缺血性半暗区,呈现为选择性神经元缺失,且需时较长 [2] 。更迟发生的迟发性神经元缺失在中度缺血数天才发生,因此称为迟发性神经元死亡(delayed nuronal death DND),早在20世纪80年代初就已明确提出脑缺血再灌流损伤中存在迟发性神经元死亡,在90年代将迟发性神经元死亡与细胞程序性死亡结合起来。近年来,许多学者利用在体脑缺血动物模型进行大量研究,从形态、生化和基因等多种角度证明,PCD在迟发性神经元死亡中起十分重要的作用 [3~5] 。我们观察到小鼠双侧颈总动脉阻断并尾部放血,短时重复缺血不同时间再灌注损伤部位及损伤程度,神经病学行为改变各不相同,而病理形态学变化在缺血再灌注后1天额叶皮层神经细胞变性,锥体细胞广泛的浓染,皱缩,部分神经细胞肿胀,苍白,顶树突延长,但细胞轮廓基本保存。细胞间质水肿。光镜下海马无明显化。再灌注3天皮层锥体细胞出现核固缩,部分神经细胞坏死,轮廓消失。海马CA 1 区出现神经细胞变性,核固缩深染,再灌注

作者: 孙博谦王红艳&n 2005-9-22
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