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首页合作平台在线期刊中华现代临床医学杂志2004年第2卷第6A期

细胞端粒酶活性定量检测在良恶性胸腹水中鉴别诊断的价值

来源:中华现代临床医学杂志
摘要:【摘要】目的探讨端粒酶活性检测对良恶性胸腹水中的鉴别诊断的价值。方法采用TRAP-银染定性法和TRAP-PicoGreen定量法,对102例患者胸水和腹水进行端粒酶活性分析。结果端粒酶定性和定量结果均显示恶性组端粒酶活性水平显著高于良性组(P0。05),定量检测细胞端粒酶活性和定性检测相比,可提高肿瘤检测的敏感性。...

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 【摘要】 目的 探讨端粒酶活性检测对良恶性胸腹水中的鉴别诊断的价值。方法 采用TRAP-银染定性法和TRAP-PicoGreen定量法,对102例患者胸水和腹水进行端粒酶活性分析。结果 端粒酶定性和定量结果均显示恶性组端粒酶活性水平显著高于良性组(P<0.05),定量检测细胞端粒酶活性和定性检测相比,可提高肿瘤检测的敏感性。结论 端粒酶活性定量检测有助于良恶性胸腹水的诊断和鉴别诊断。

关键词 端粒酶 胸水 腹水 肿瘤

The diagnostic value of hydrothorax and hydroperitoneum telomerase

activity in distinguishing a malignant from a nonmalignant effusion

Yue Zhihong,Zhang Zheng,Ma Liping,et al.

The Pepole’s Hospital,Peking University,Beijing100044.

【Abstract】 Objective To study on the clinical value of telomerase activity in ascites/pleural effusions.Methods The telomerase activity in ascites/pleural effusions was detected in102specimens of effeusion cells by TRAP-PicoGreen assay and the results of detecting telomerase activity was compared with the cytological diagnosis.Results Positive rate of telomerase activity in malignant groups was significant higher than that detected in benign groups(P<0.05).Conclusion Detection of telomerase activity in the effusions can be a promising diagnostic method in differential diagnosis of benign and malignant ascites/pleural effusions.

Key words telomerase activity pleural effusion ascites tumor

正常细胞中端粒随细胞分裂呈进行性缩短,端粒酶是一种逆转录DNA合成酶,具有使端粒延伸并维持其稳定的作用。它的激活可稳定端粒长度甚至使细胞获得永生。由于大多数恶性肿瘤及细胞株端粒酶活性高表达,因此端粒酶是目前已知的最通用的肿瘤分子标志物。本文采用TRAP-PicoGreen方法定量检测了102例胸水和腹水标本中端粒酶活性,探讨其在鉴别良恶性胸腹水中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 病例选择 本院和北大医院自2003年3月~2004年1月102例患者的胸水和腹水标本。恶性组60例,男25例,女35例,年龄32~90岁,其中肺癌23例,卵巢癌15例,肝癌6例,乳腺癌6例,子宫内膜癌3例,胃癌2例,直肠癌、恶性横纹肌瘤、白血病、胰腺癌、膀胱癌转移各1例。见图1。良性组42例,男27例,女15例,年龄15~91岁,其中结核性21例(结核性胸膜炎20例,结核性腹膜炎1例),肝硬化7例,肺炎6例,肾衰4例,心衰2例,脊髓炎1例,腹膜浆液性囊肿瘤1例。所有病例诊断均经病理学和(或)影像学证实。胸水收集前2~3周患者均未接受化疗。阳性对照k562细胞由本院中心实验室提供。体液脱落细胞病理学诊断由本院和北大医院病理科提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞端粒酶提取 取新鲜胸水或腹水标本100ml,对混有红细胞的血性标本加入红细胞裂解液摇匀,室温静置20min。4℃3000rpm离心10min,弃去上清,反复裂解3 次,直至细胞变白。加入DEPC处理过的PBS洗涤,4℃3000rpm离心10min,弃上清,反复2次。加入预冷的细胞裂解液100μl,其中PMSF单独加入1μl,冰浴30min。4℃16000rpm离心20min吸取上清置-70℃保存备用。

1.2.2 蛋白浓度测定(Branford法) 以牛血清白蛋白(BSA)配制标准蛋白溶液。分别取20μl加入1000μl考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue G-250)蛋白反应液,混匀,室温静置2min后在分光光度计595nm测定光吸收值。以蛋白浓度为横坐标,光吸收值为纵坐标绘制标准曲线,线性范围为0~1.5μg/μl。即可相应测定标本的蛋白浓度。该方法为定量端粒酶的基础。

1.2.3 TRAP扩增 在50μl反应体系中加入反应液40μl,标本7.5μl(蛋白含量最高为6.0μg)后,于30℃反应60min,进行底物延伸。在延伸后产物中加入ACX引物2μl、Taq酶2.5单位、液体石蜡40μl,94℃预变性5min后循环25周,循环条件为变性(94℃)30s、退火(50℃)30s、延伸(72℃)90s,72℃后延伸10min后中止反应。每次TRAP反应时以k562细胞株1μg蛋白提取液作为阳性对照,不加标本提取液为阴性对照。

1.2.4 扩增产物检测

1.2.4.1 定性检测 将10μlTRAP产物与含溴酚蓝的6×凝胶载样缓冲液2μl混合,在120V的电压下,进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,直至电流使溴酚蓝色带泳出凝胶为止。固定银染显色后,出现4条以上间隔6bp的梯度条带者为端粒酶活性阳性,否则为阴性。

1.2.4.2 定量检测 取TRAP产物4μl,加入PicoGreen工作液200μl混匀5min后于激发波长480nm、发射波长520nm读图1 病例分组1=结核,2=肝硬化,3=肺炎,4=其它良性,6=肺癌,7=卵巢癌,8=肝癌,9=乳腺癌,10=其它恶性取荧光值。以鲑鱼精DNA配制标准DNA溶液,绘制标准曲线,线性范围为0~200ng/ml,即可相应测定产物的DNA浓度。实际荧光值为每个样本实测值减去阴性对照后的结果。从而计算每微克蛋白催化产生的DNA量(ngDNA/μg蛋白,以下简称为ng/μg)。与银染结果比较,端粒酶活性在约20ng/μg以上时,银染结果阳性,反之则为阴性。本次实验阳性对照的端粒酶活性为(65.67±16.72)ng/μg

1.3 统计学方法 端粒酶活性以均值±标准差表示,所有数据均由Microsoft Excel2000和SPSS10.0软件处理。两组间计数资料比较采用χ 2 检验,计量资料比采用t或t′检验。三组间计量资料比较采用ANOVA。P<0.05,样本间均数差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体液细胞端粒酶活性定性检测结果 在102例胸水和腹水中,60例恶性组端粒酶阳性检出率68.3%(41/60)显著高于42例良性组端粒酶阳性检出率21.4%(9/42)(χ 2 =21.750,P<0.05)。其中60例恶性组端粒酶活性定性检测结果和脱落细胞病理学诊断比较见表1。在60例恶性组中,经端粒酶活性定性检测,其中25例病理学检查阳性者有19例端粒酶活性呈阳性,4例病理学可疑者有3例端粒酶活性阳性;31例病理学阴性者有19例端粒酶活性阳性,共有41例检测到端粒酶活性。端粒酶阳性检出率68.3%(41/60)与病理学诊断的阳性率48.3%(29/60)比较,差异有显著性(χ 2 =4.654,P<0.05)。其中病理学阴性者19/31(61.3%)与病理学阳性者端粒酶阳性检出率22/29(75.9%)比较,差异无显著性(χ 2 =1.470,P>0.05)。

表1 60例恶性组病理学诊断与端粒酶活性定性检测结果

2.2 体液细胞端粒酶活性的定量检测结果 在102例胸水和腹水中,恶性组端粒酶活性水平与良性组比较,两组间差异有统计学意义(t′=6.801,P<0.05),结果见表2。以体液细胞中不同端粒酶活性水平做为鉴别良恶性体液的cut-off值,则可计算其敏感性和特异性,根据结果可绘出端 粒酶定量检测的ROC曲线,结果见表3和图2。根据ROC曲线可知,端粒酶活性的cut-off值设定为18ng/μg,其敏感性为71.67%(43/60),特异性为71.43%(30/42)。图2 体液细胞端粒酶活性的ROC曲线

表2 102例端粒酶活性水平的比较

表3 端粒酶检测的敏感性和特异性

2.3 结核组、非结核组和肺癌组端粒酶活性的比较 在102例胸水和腹

作者: 岳志红张正&nb 2005-9-22