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首页合作平台在线期刊中华现代临床医学杂志2004年第2卷第6A期

中华眼镜蛇毒组分抑制肺癌细胞H1299诱导的血管内皮细胞迁移的研究

来源:中华现代临床医学杂志
摘要:基金项目:广东省自然科学基金项目(980463)卫生部科技基金项目(98-2-349)共同资助【摘要】目的观察中华眼镜蛇毒组分P7(NajanajaAtravenomactivefactorP7,FP7)对人非小细胞肺癌细胞株H1299诱导的血管内皮细胞迁移的影响,并对H1299表达的VEGF、bFGF进行检测,探讨P7抗血管生成的机制。方法采用Tranˉswel......

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  基金项目:广东省自然科学基金项目(980463) 卫生部科技基金项目(98-2-349)共同资助

【摘要】 目的 观察中华眼镜蛇毒组分P7(Naja naja Atra venom active factor P7,FP7)对人非小细胞肺癌细胞株H1299诱导的血管内皮细胞迁移的影响,并对H1299表达的VEGF、bFGF进行检测,探讨P7抗血管生成的机制。方法 采用Tranˉswell共培养模型观察P7对H1299诱导血管内皮细胞ECV304迁移的抑制作用;免疫组化法检测不同浓度P7作用下H1299中VEGF、bFGF的表达。结果 该蛇毒组分P7在1.0、2.0、4.0μg/ml抑制H1299诱导下的内皮细胞的迁移,抑制率分别为28.2%、60.3%、71.4%,呈剂量效应关系;在4.0μg/ml时明显抑制H1299细胞表达VEGF、bFGF。结论 本研究首次证实在适当浓度时中华眼镜蛇毒组分P7对H1299诱导的血管内皮细胞的迁移有抑制作用,并可降低H1299细胞血管生成因子的表达,表明以上作用可能是P7发挥抗血管生成的机制之一。

关键词 中华眼镜蛇毒 肺癌细胞 内皮细胞 迁移 血管内皮生长因子 碱性成纤维细胞生长因子

The inhibitory effect of naja naja atra snake venom fraction

on endothelial cell migration induced by lung cancer cell

Yu Honge,Yu Qingsheng,Liu Xinyan,et al.

Guangzhou Research Institute of Snake Venom,Guangzhou Medical College,Guangzhou510182.

【Abstract】 Objective To investigate the effect of naja naja atra snake venom fraction(P7)on the migration of endothelial cell induced by lung cancer cell in vitro.Methods Cells of human umbilical vein endothelial cell line(ECV304)and human lung carcimoma cell line(H1299)were co-cultured in Transwell system,and the effect of fraction on the migration of ECV304induced by H1299was investigated;The VEGF and bFGF expression in H1299were examined correspondingly by immunohistochemical staining.Results The fraction significantly inhibited migraˉtion of ECV304cells induced by H1299cells in a dose-dependent manner,and the inhibition ratio could respectiveˉly get to28.2%、60.3%and71.4%in1.0μg/ml、2.0μg/ml and4.0μg/ml;meanwhile the expression of VEGF and bFGF were reduced after treatment with4.0μg/ml FP7.Conclusion These results clearly demonstrate that anti-angiogenesis activity of naja naja atra snake venom possibly resulted from inhibiting endothelial cell migration and decreasing the expression of VEGF and bFGF.

Key words naja naja atra snake venom lung cancer cell endothelial cell migration VEGF bFGF

肿瘤血管生成的过程中血管内皮细胞向肿瘤移行是一个重要环节。它是一个诱导血管生成因子和抗血管生成因子相互作用的复杂过程,因此阻断此过程的发生就能有效控制肿瘤血管生成。其中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是两种重要的血管生成因子,具有明显的促血管生成作用,与肿瘤的预后及转移有着密切的关系。多数研究表明蛇毒作为一类特殊的混合物,在治疗血栓、止血、镇痛和抗肿瘤等 [1~3] 方面很有潜力,对肿瘤的血管生成方面也有一定的抑制作用。因此本项目旨在探讨中华眼镜蛇毒组分对肺癌细胞诱导的血管内皮细胞迁移的影响,从而进一步研究其抗血管生成的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 中华眼镜蛇毒(Naja naja atra)活性组分P7(Naja naja Atra venom active factor P7,简称FP7),由中国科技大学生物科学学院提供。人脐静脉内皮细胞株ECV304,购自中山大学北校区医学实验动物中心细胞库。人非小细胞肺癌细胞株H1299由本校李冰教授惠赠。带8μm聚碳酸酯微孔滤膜的Transwell为COSTAR产品。VEGF兔多克隆抗体为SIGNET产品。Biotin SP-HRP试剂盒购于北京鼎国生物技术发展中心。bFGF免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒BOSTER公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞迁移实验 [4] 消化计数H1299细胞,调整密度为1×10 5 个/ml,按0.6ml/孔接种于Transwell的下室中。待细胞贴壁后,吸出培养液用D-Hanks溶液冲洗2次,实验组各孔加入各浓度的蛇毒组分FP7为1.0、2.0、4.0μg/ml,同时设含bFGF(终浓度为20ng/ml)的培养基为阳性对照,未用FP7处理的H1299细胞为阴性对照,无H1299细胞的培养基为空白对照。另消化计数ECV304细胞调密度为1×10 5 个/ml,按0.1ml/孔加入Transwell的上室中轻轻振荡使之分布均匀,置37℃二氧化碳培养箱进行H1299-ECV304的联合培养。6h后取出Transwell,用棉签小心拭去上室底膜上面的细胞,下面的细胞用D-Hanks溶液冲洗3次后95%乙醇固定,D-Hanks溶液冲洗、苏木素染色,水洗或伊红染色,水洗。将Transwell整室倒置于普通显微镜下观察,并随机取4个视野进行计数(×100),取其平均数计算细胞迁移的抑制率:细胞迁移抑制率=(对照组迁移细胞数-实验组迁移细胞数)/对照组迁移细胞数×100%。蛇毒组分FP7每个浓度实验3孔,重复3次实验。

1.2.2 蛇毒组分P7对H1299细胞VEGF和bFGF表达的测定 实验组经不同浓度的FP7(终浓度分别为1.0、2.0、4.0μg/ml)处理H1299细胞后,用4%多聚甲醛PBS液固定,采用SP法进行VEGF、bFGF免疫组化染色,按试剂盒说明操作。同时设有空白对照(用PBS代替VEGF、bFGF一抗)、替代对照(用正常动物的非免疫血清代替VEGF、bFGF一抗)、阴性对照(未经FP7处理)。以肿瘤细胞浆呈明显的棕黄色为阳性染色来判断结果。每张片随机选择3个视野,在高倍镜(×200)计数每个视野100个肿瘤细胞中阳性细胞的比例,取3个视野的平均百分数为判定结果。参照Uchida等 [5] 的标准取阳性细胞<10%为阴性(-),10%~50%为阳性(+),>50%为强阳性(++)。

1.3 统计学方法 计量数据以均数±标准差表示,等级资料用卡方检验,采用SPSS11.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 FP7对肺癌细胞H1299诱导内皮细胞迁移的影响 当Transwell下室内无H1299细胞时,移行到膜下的内皮细胞数较少;当下室内有未用FP7处理的H1299细胞时,可见到迁移的内皮细胞数较多(见图1);当用1.0、2.0、4.0μg/ml不同浓度的FP7处理H1299细胞后,迁移的内皮细胞数随P7浓度的增加而减少,两者呈负相关(r=-0.848,P<0.01)迁移抑制率分别为28.2%、60.3%、71.4%,与阴性对照组相比差异有显著性(见表1)。

表5 不同浓度的中华眼镜蛇毒组分FP7对ECV-304迁移的影响

2.2 FP7对H1299细胞VEGF、bFGF蛋白表达的影响 肺癌细胞H1299的VEGF和bFGF表达均较强,都主要定位于细胞浆内。当4.0μg/ml FP7作用后,H1299细胞VEGF、bFGF蛋白表达的阳性明显减弱。见表2、3和图2、3。

表2 不同浓度的中华眼镜蛇毒组分FP7对H1299细胞VEGF表达的影响

以上四组经Chi-Square检验得χ 2 =21.547,与阴性对 照组比较P<0.05。

表3 不同浓度的中华眼镜蛇毒组分FP7对H1299细胞bFGF表达的影响

以上四组经Chi-Square检验得χ 2 =15.239,与阴性对照组比较P<0.05。

3 讨论

肿瘤的生长和转移,依赖于肿瘤内新生血管形成,研究表明当肿瘤的体积超过1~2mm 3 时,要继续发展或转移,必须要有足够的氧气和营养供应,同时带走代谢产物 [6]。血管的形成受大量的促进因子和抑制因子的调节,在多种促进因子中,最重要的有VEGF和bFGF。VEGF不但特异性高,而且作用强大 [7,8] 。它是一种由肿瘤细胞分泌的二聚体多肽,相对分子量为34000~45000 [9] ,是一种血管内皮细胞分裂素,由肿瘤细胞经自分泌或旁分泌途径分泌,与受体

作者: 余红娥 余清声 刘新艳腾脉坤 2005-9-22