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基金项目:广东省深圳市科技计划资助项目（No.200204116）
【摘要】 目的 探讨 99m Tc-BDI-1的标记和人膀胱癌荷瘤裸鼠显像方法，为临床应用做好准备。方法 用亲和层析柱纯化的抗人膀胱癌单克隆抗体BDI-1。用2-巯基乙醇直接还原法标记 99m Tc-BDI-1。用薄层层析测定 99m Tc-BDI-1的放化纯度。用EJ细胞测定 99mTc-BDI-1标记抗体的免疫活性分数及亲和常数。用人膀胱癌荷瘤裸鼠进行 99m Tc-BDI-1显像。结果 99m Tc-BDI-1抗体标记率为70.1%，放射化学纯度92.1%，免疫活性分数80.5%。荷瘤裸鼠影像清晰、对比度良好， 99m Tc-BDI-1在瘤体部位的浓集明确，瘤体清晰可辨。结论 99m Tc-BDI-1能够穿过肿瘤组织中的血管壁进入肿瘤组织，并保留了抗体的亲合力和特异结合力。 关键词 膀胱肿瘤 抗体 单克隆 放射性核素显像
The study of labelled 99m Tc-BDI-1and the imaging of nude mice with humanbladder neoplasm Ye Jiongxian，Shi Yu，Hu Jinsen，et al. Peking Univ.Shenzhen hospital，Guangdong518036. 【Abstract】 Objective To explore the labelled of 99m Tc-BDI-1and the method of imaging of nude mice with human bladder neoplasm，and preparing for the clinical apply.Methods Using affinity chromatography rarefied single clone antibody to human bladder neoplasm BDI-1.Labelled 99m Tc-BDI-1by deoxidizing2-mercapˉtoethanol directly.Measure the radio-chemical purity of 99m Tc-BDI-1by thin layer chromatograph.Measure the 99m Tc-BDI-1immunocompetence fraction and affinityconstant of labelled antibody by EJ cell.Use nude mice with human bladder neoplasm to process 99m Tc-BDI-1imaging.Results The rate of Labelled 99m Tc-BDI-1antibody is70.1%，the radio-chemical purity is92.1%，the immunocompetence fractionis80.5%.The images of nude mice with the tumor are clear with good contrast， 99m Tc-BDI-1dense in the body part of the tumor is definite，and the tuˉmor is clear.Conclusion 99m Tc-BDI-1can go through the tumor vessel wall and get into the tumor，and keep the antibody’s affinity and the special combining ability. Key words bladder neoplasms antibody monoclonal radionuclide imaging 膀胱癌是泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤。Bamias等 ［1］ 标记 111 In抗膀胱癌单克隆抗体AUA1成功地进行肿瘤显像，引起广泛关注。抗人膀胱癌单克隆抗体BDI-1也能和人膀胱相关抗原特异性结合 ［2～3］ ， 131 I-BDI-1标记物人体膀胱癌的实验性显像较为清晰 ［4，5］，而且 99m Tc-BDI-1人体膀胱癌放射免疫显像剂也成功试用于人体 ［6～9］ 。为了使99m Tc-BDI-1显像剂更好地用于临床研究，本文对其标记方法和荷瘤裸鼠显像进行了探讨。报告如下。 1 材料与方法 1.1 细胞株和裸鼠 人膀胱癌EJ细胞株由北京大学泌尿外科研究所提供，常规方法传代培养。EJ细胞用于测定 99m Tc-BDI-1标记抗体的免疫活性分数及亲和常数。ICR来源的裸小鼠，6～8周龄，由中山大学实验动物中心提供。 1.2 方法 1.2.1 BDI-1单克隆抗体的纯化 向Balb/c小鼠腹腔注射抗人膀胱杂交瘤细胞5×10 6 个，10天后收集腹水，经饱和硫酸铵沉淀后过ProteinG-agarose（德国Boehringer Mannheim公司提供）亲和层析柱，获得纯化的抗人膀胱癌单克隆抗体BDI-1（IgG）。经浓缩、鉴定后分装-80℃保存，待用。 1.2.2 99m Tc-BDI-1的标记和纯化 首先，用2-巯基乙醇（德国Boehringer Mannheim公司提供）直接还原BDI-1 ［8］ 。在内含150μg BDI-1抗体的溶液中加入2-巯基乙醇5μl，摇匀，30℃水浴中孵育30min，加入Sephadex-G50柱（7mm×8mm）中分离，用pH7.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，收集第一峰。然后标记和纯化 99m Tc-BDI-1。 99 Mo- 99 Tc m 发生器为中国原子能科学研究院提供。注射用亚锡亚甲二磷酸盐（MDP）冻干品（批号:20031212）亦由中国原子能科学研究院提供，每支含MDP5mg，SCI 2 ·2H 2 O0.5mg。用2ml生理盐水溶解MDP，取40μl加入上述还原后的BDI-1抗体反应瓶内。再加入 99m TcO 4 -185MBq/0.5ml，室温下摇动反应15min。将反应产物移入Sephadex-G50柱（10mm×150mm）中分离，用pH7.4的0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，收集到的第一峰即为 99m Tc-BDI-1。 1.2.3 99m Tc-BDI-1抗体的鉴定 99m Tc-BDI-1的放化纯度测定按文献 ［9］ 方法，以硅胶板为支持物，以生理盐水为展开剂，行薄层层析分析。 99m Tc-BDI-1标记抗体的免疫活性分数及亲和常数的测定按文献 ［10］ ，同一浓度的标记抗体与不同浓度的E-J细胞在室温下反应3h后测定每管的cpm值（T值）及细胞结合的cpm值（B值）。以细胞浓度的倒数为横坐标，T/B为纵坐标，作图计算出标记抗体的免疫活性分数。 1.2.4 荷瘤裸鼠培育和 99m Tc-BDI-1显像 ICR裸小鼠15只，肩部皮下接种5×10 6 个EJ细胞，4周后长成直径1cm的人膀胱癌肿物。将荷瘤裸鼠分5组，经尾静脉分别注射不同量的99m Tc-BDI-1标记抗体，即6.0MBq/0.3ml、12.0MBq/0.3ml、18.0MBq/0.3ml、24.0MBq/0.3ml、30.0MBq/0.3ml。分别在注射后4h、8h、16h和24h进行显像。 显像设备是SIEMESN E.CAM/ICON双探头SEPET仪，探头配置低能通用型准直器。采集静态影像，采集条件:Zoom=3.20，256×256矩阵，能窗宽度20%（峰位140keV）。采集时间8min。然后勾画感兴趣区，提取计数，定量测定肿瘤内摄取 99m Tc-BDI-1标记抗体的数量和活性。 2 结果 2.1 标记率及放化纯度 99m Tc-BDI-1抗体标记率为70.1%;标记物经Sephadex-G50分离纯化后，用薄层层析法测定放射化学纯度。放射化学纯度>92.1%。 2.2 标记抗体的免疫活性分数及亲和常数测定 标记抗体的免疫活性分数为80.5%;不同稀释度的标记抗体与同一浓度的细胞室温下反应3h后，以Scatchard作图法检测出标记抗体 99m Tc-BDI-1对EJ细胞膜表面抗原的亲和常数为1.31×10 -9 M -1 。 2.3 荷瘤裸鼠培育和 99m Tc-BDI-1显像 99m Tc-BDI-1经荷瘤裸鼠尾静脉注射后分别在4、16、22h显像。获得的影像清晰、对比度良好，随着时间的延长，本底逐渐降低， 99mTc-BDI-1在瘤体部位的浓集量增多，22h时瘤体清晰可辨。显像结果表明 99m Tc-BDI-1能够穿过肿瘤组织中的血管壁进入肿瘤组织，并保留了抗体的亲合和特异结合力。 3 讨论 膀胱肿瘤是泌尿生殖系统中最常见的肿瘤，其中上皮性肿瘤占98%，而移行细胞癌（BTCC）占上皮肿瘤的90%以上，临床上占有重要的地位。特点是发病率高、复发率高、治疗较复杂，单纯TUR术的初发膀胱癌1年复发率达43%，复发性膀胱癌1年再发率高达70%，大多数复发于6～12个月内 ［12］ 。因此，提高生存率、预防复发一直是临床关注的热点之一。免疫疗法在预防膀胱癌复发中取得了一定的疗效，但由于免疫毒素作为一种异种蛋白，进入血流后可很快产生抗免疫毒素的抗体，因而限制了免疫毒素经血液的应用，成为免疫毒素治疗肿瘤的一大障碍。 膀胱是一个与外界相通的腔形器官，免疫毒素通过灌注进入膀胱，由于不经过血循环，多次灌注没有产生抗免疫毒素抗体的机会。但免疫毒素使用量大、对于较大的肿瘤效果不佳。Bamias等 ［1］ 用放射性核素成功地标记膀胱癌相关单克隆抗体经膀胱灌注，不但为治疗膀胱癌提供了新的方法，而且在体外可以用影像设备显示浓集在靶点病灶的数量、停留时间，并可以计算出靶点病灶接受的辐射剂量。BDI-1是一种抗人膀胱癌单克隆抗体 ［2］ ，特异地和膀胱癌细胞结合，它可以作为膀胱癌特异的导向载体，制备多种免疫偶物，用于肿瘤的诊断、治疗及预防复发。放射性核素标记的BDI-1单克隆抗体已被用于膀胱癌的诊断和治疗，并见多篇报道 ［2～10］ ，特别是用放射性核素标记BDI-1 单克隆抗体治疗膀胱癌前景非常乐