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丙型肝炎病毒（HCV）是一种有包膜的单正链RNA病毒，其RNA约有9.6kb，它编号一种约3000个氨基酸的多聚蛋白。该蛋白可被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶水解为十个不同产物。在氨基终端的1/3分裂成结构蛋白（包括核心蛋白、胞膜蛋白1、胞膜蛋白2和p7），剩余部分形成非结构蛋白（包括NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。虽然非结构蛋白（NS）不是病毒粒子的构成部分，但在病毒复制中起到非常重要的作用。1999年Lohmann等人在人肝癌细胞Huh7系中建立了HCV亚基因复制子，其组成为HCV IRES（5’非编码区的1至377个核苷），新霉素磷酸转移酶基因，NS3-NS5的编码区，脑心肌炎病毒的内在核糖体进入部位（即IRES，它可以介导HCV非结构蛋白的翻译）以及HCV的3’非编码区 ［1］ 。从这个复制子中可以看出HCV RNA的复制可能并不需要结构蛋白和NS2的参与，但非结构蛋白NS3-NS5是起重要作用的。随后也有试验支持这一点 ［2］ 。
1 各种非结构蛋白的生物性状
NS2和NS3氨基端组成NS2-3蛋白酶，在NS2/3区催化分裂。NS3是一种具有双重功效的分子，在氨基端有丝氨酸类型的蛋白酶可催化分裂，在羧基端剩余部分具有三磷酸核苷酶（NTPase）和螺旋酶（helicase）活性，是HCV基因翻译和复制所必须的酶 ［3，4］ 。另外，NS3还具有干涉宿主细胞功能的特性。例如，它可以抑制细胞蛋白激酶A介导的信号转换或细胞转化。NS4B具有疏水性，但它的功能还不太清楚。NS5A是一种高价磷酸化蛋白，而且至少在一些HCV分离株中，NS4A通过直接与NS5A作用而影响磷酸化水平 ［5～7］ 。NS5A的磷酸化是由一种细胞激酶所介导的，在HCV-H分离株中，NS5A磷酸化的主要位点在多聚蛋白的2321个丝氨酸上，且该侧链脯氨酸富集，可能说明脯氨酸定向激酶（proline-directed kinase）为NS5A磷酸化所必需 ［8］ 。NS5A在RNA复制中的作用还不是很清楚，但是通过对其它RNA病毒的研究与推测，我们可以推测出NS5A是HCV RNA复制的重要调节者。另外，NS5A还与感染细胞耐受干扰素抗病毒作用有关。至少，在一些HCV分离株中，NS5A能够与PKR结合，从而阻止被干扰素处理的细胞的减少 ［9］ 。还有，用丙氨酸替代磷酸化主要位点第2321个丝氨酸并不影响NS5A与PKR的相互作用，显示在这特定位点的磷酸化并不是NS5A与PKR结合所必需 ［8］ 。在各种试验中显示NS5B是一种RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp） ［10，11］ 。
2 病毒复制中，非结构蛋白在宿主细胞中的定位
很多RNA病毒的复制是一个复杂的过程，它们通过蛋白与RNA以及蛋白与蛋白之间的相互作用产生多肽蛋白。正链RNA病毒的复制是在一种与宿主细胞膜相连的病毒复制复合物（RC）中进行的，该复合物由病毒蛋白、细胞蛋白及病毒RNA组成 ［12，13］ 。尽管人们对HCV RNA的复制了解不多，但根据与相似病毒复制机制的对照以及对HCV RNA复制的研究，人们认为HCV RNA的复制是在一种由HCV非结构蛋白和细胞蛋白组成的与细胞内膜相连的蛋白复合物中进行的。即该病毒复制复合物由HCV NS、HCV RNA和宿主细胞蛋白组成，并且与细胞核周内质网（ER）膜相连 ［14，15］ 。这种看法的基础是HCV NS局部定位于内质网膜并且NS之间相互作用。例如NS5B与HS3和NS5A一起共同定位和相互作用，同样，NS4A与NS4B和NS4A相互作用。另外，NS5A和NS5B都与人载体相关性膜蛋白（一种细胞蛋白，简称hVAP-33）的N端和C端相互作用。hVAP-33主要与膜相连，这可说明HCV RNA复制复合物与膜相连 ［16］ 。还有，Brass、Srass和Schmidt-Mende等人发现，NS5A和NS5B分别通过N-终端的两性a-螺旋区和C-终端的疏水区与内质网膜直接相互作用 ［17］ 。Nazira EI-Hage等人在HCV亚基因复制子试验中发现，当内质网没受破坏时，RC中的HCV-RNA能够较强的耐受RNA酶A/T1的消化作用，但当内质网曹破坏时，HCV-RNA对RNA酶A/T1的作用变得非常敏感。显然，内质网膜保护HCV-RNA免受RNA酶的消化。它提示HCV的RC是在内质网的内腔或者起源于内质网的膜结构中被装配 ［18］ 。
综上可知，HCV RNA复制发生在细胞的ER膜中（比如被病毒蛋白诱导的膜泡/膜小球）。其原因如下:（1）许多RNA复制所需要的NS通过疏水的膜锚定区锚定在ER膜上;（2）由病毒蛋白诱导的膜泡、膜小球等膜结构把病毒RC从细胞胞质的敌对环境中分隔开来。否则，病毒RNA暴露在细胞胞质中，很容易受到不同核酸酶的攻击而退化;（3）RNA的复制要求与膜相连的宿主细胞蛋白。
3 非结构蛋白在HCV复制中的作用机制
3.1 HCV复制的循环过程 HCV复制可以总结如下:（1）病毒穿透进入宿主细胞并在细胞质中释放RNA;（2）翻译输入的RNA，进行多聚蛋白的合成及形成与细胞内膜相连的复制酶复合物;（3）利用输入的正链RNA合成中间产物负链RNA;（4）产生新的正链RNA，该新链能用于合成新的负链RNA及多聚蛋白的表达或子代病毒子的包装;（5）从感染的细胞中释放病毒。而NS在HCV复制中的作用主要表现在多聚蛋白的处理和HCV-RNA的合成上。
3.2 非结构蛋白在多聚蛋白处理中的作用机制 HCV-RNA的翻译目前认为是由IRES介导的，并且在宿主细胞分裂中受细胞蛋白调控 ［19］ 。多聚蛋白在IRES的调控下，在细胞的粗面内质网中被翻译，并且在细胞信号酶和两种病毒蛋白酶的作用下分裂。C-NS2在宿主信号肽酶的作用下，在C/E1、E1/E2、E2/p、p7/NS2的连接处裂开。在NS2和NS3之间的处理是一种迅速的分子内反应，它是由NS2-3蛋白酶完成的。在这个部位的处理要求NS2羧基端的130个氨基酸的NS3起始端的180个氨基酸。在NS2序列中，氨基酸残基His-952和Cys-993是酶活性的关键所在，并可认为，NS2-3是一种具有由His-952和Cys-993形成的接触反应二重体或His-952、Cys-993和Glu-972形成的接触反应三重体的半胱氨酸蛋白酶 ［20］ 。NS2-3蛋白酶可以被锌活化或者被螯化物（如EDTA）抑制，它可能是一种锌依赖金属蛋白酶。但因为锌是NS3蛋白酶区适当折叠所必需，所以，是否锌也与NS2区相连或者该活化作用是由于NS3区的适当折叠所致，人们并不清楚。同时，锌与NS3区相连在催化作用中可能起重要作用 ［21］ 。NS3-5B区的处理是由NS3蛋白酶介导，主要以如下分裂顺序进行NS3/4A→NS5A/B→NS4A/B→NS4B/5A。在NS3/4A部位的处理是一种共同翻译的分子内反应，在其它部位的分裂可以是分子间反应，然而HCV蛋白更可能形成一种与细胞内膜相连的稳定性高的序列复合物 ［22，26］ ，这样，即使NS3从多聚蛋白中释放后，酶和底物也是非常接近的。 在不同的体外试验中，NS3的酶活性的活化主要由NS4A刺激。研究显示，NS3和NS4A的联合体的相互作用区在NS3终末端的30个氨基残端和NS4A中心的12氨基序列上。因为联合体的突变消除彻底的减弱蛋白酶活性，人们设想NS4A与NS3的相互作用诱导蛋白区的构象改变，这种设想被NS3蛋白酶的三维X线结构和NS3与一种人造的NS4A缩氨酸联合所证明 ［23，24］ 。该酶采用类似糜蛋白酶的折叠，由两个β-桶状区（β-barrel区）组成，这两个区由一条较深的裂缝分开，而由氨基酸残基组成的接触反应三重体就在裂缝中。在羧基端形成一个六链β-barrel。在没有NS4A的情况下，NS3终端的30个氨基残基容易变形和从蛋白处伸展开去，然而在NS4A存在的条件下，该区具有高度的结构稳定性。NS3与NS4A连接后的结构重整导致该复合物在几何学上的最佳化，而大大增强蛋白酶的活性。除了作为一种蛋白酶联合子外，NS4A还有另外两种作用可能增加多聚蛋白的分裂和复制，第一，它可以增加NS3的代谢稳定性，而在缺乏NS4A时，NS3退化非常快;第二，它可以促使NS3锚定到细胞内膜上，而大多数病毒蛋白定位在这里，这样，有利于增加酶-底物的局部浓度和促使与膜相连的复制酶复合物的形成 ［25］ 。
正链RNA病毒家族有一个特征，那就是蛋白酶、三磷酸腺苷酶、螺旋酶活性位于单一多肽上，在HCV的NS3上也发现这样的特征。（1）尽管单独的蛋白酶区和全链的NS3的接触反应活性非常相似，但是在螺旋酶上并不是这样。对于重组单链N4S4A-全链NS3、不联合NS4A的全链NS3及单独的螺旋酶区，在RNA的解链活性的比较上可以看出，存在蛋白酶区和NS4A可以提高螺旋酶活性 ［26］ 。这种提高可能是因为以下原因:第一，促使螺旋酶稳定的折叠在复合物中。第二，在蛋白酶区的RNA联合部位促使螺旋酶与底物的联合。（2）全链NS3的单链可溶蛋白及NS4A催化区的X线三维晶体结构的确定显示，蛋白酶区、三磷酸腺苷酶和螺旋酶区是分隔的，并通过一种易变形的单链相连 ［27］ 。在这分子中，NS3的羧基端占领蛋白酶的活性部位。这个观察结果显示，蛋白酶的自身抑制可以通过与多聚蛋白底物的相互作用而得到消除。因为这种相互作用可以诱导蛋白酶的结构改变及使抑制物从酶活性位点转移。
3.3 非结构蛋白在RNA复制中的作用机制 在HCV RC中NS和RNA在局部停留，并且使不同多肽链的功能残基紧紧连接在一起。在RNA复制中，不管是正链还是负链RNA的合成，NS5B RdRp都起着重要作用。在体外RNA合成试验中，该酶主要作用于引物依赖性启动的RNA合成。其作用机制是通过延长的引物杂交到RNA聚合酶上，或者在使用杂聚模板时通过拷贝支持（copy-back）机制。在3’端折叠和杂交的序列产生一个能够延长到输入模板两倍长的末端。不管怎样，HCV NS5B至少在某些试验条件下能够使RNA的合成重新开始，而且该机制也在体内试验中发现 ［28～30］ 。令人感兴趣的是，当使用高浓度的三磷酸鸟苷（GTP）或三磷酸腺苷（ATP），HCV NS5B能够分别从均聚模板poly（C）和poly（U）上独立的合成RNA引物，然而不管三磷酸核苷（NTP）的浓度怎样，从poly（I）和poly（A）模板上的RNA复制是引物依赖性的 ［29］ 。这些结果提示该酶仅仅能够使用GTP或ATP来重新启动RNA复制。有趣的是，不管是正链还是负链RNA的5’终端核苷都相应是鸟嘌呤或腺嘌呤。但是在RNA复制中模板的特异性是怎样获得的呢?在很多研究中，人们发现NS5B被用于和连接各种RNA（甚至是DNA）模板上。另外，有证据显示，重组子NS5B被优先连接到NS5B基因3’端编码区的序列上 ［31］ 。可见，模板特异性可能是通过在复制复合物中局部高浓度的NS5B和需要翻译的RNA基因来完成的。虽然在体外试验中NS5B甚至能够编码一条完整的全长基因，但是，在生物体内却很可能需要别的病毒因子或细胞因子参与。病毒因子可能是NS3螺旋酶，该酶可以展开RNA模板中的稳定结构，便于RNA的复制或NS5A的磷蛋白化。从其它RNA病毒复制机制中我们可以类推到NS5A参与RNA复制的调节，而且NS5A的磷酸化在病毒复制中也起重要作用 ［32］ 。
总之，非结构蛋白作为HCV复制复合物的重要组成部分在HCV的复制中起着重要的作用。而研究非结构蛋白在病毒复制中的作用机制，可以为设计新的或者更有效的抗HCV的治疗方法提供重要的思路。
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（收稿日期:2004-03-17）
（编辑李 阳）
作者单位:410008湖南长沙中南大学湘雅医院感染病科