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【摘要】 目的 利用双向电泳及双向免疫印迹技术研究户尘螨过敏原。方法 纯种户尘螨螨体原料购自Allergon，Inc.，ngelholm，Sweden。用Trizol法提取纯种户尘螨螨体蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）检测法测定蛋白质含量，双向电泳及双向免疫印迹技术确定户尘螨过敏原。结果 等电点和分子量分别为5.4，25.6KD的过敏原组分（以下表示方法相同）对应于Der p1;7.6～9.0，15.2KD对应于Der p2;8.1～8.5，28.5～28.6KD对应于Der p3;6.5～7.0，61.0～62.0KD对应于Der p4;7.0～7.3，14.8KD对应于Der p5;5.9～6.1，25.5～25.8KD对应于Der p6;6.9～7.1，26.5KD对应于Der p7;6.8～7.0，24.9KD对应于Der p8;8.8，28.1KD对应于Der p9;6.5～6.8，36.4KD对应于Der p10。与Le Mao一文比较 ［3］ ，本实验发现了与c、d、e、f点相似特征的C、D、E、F点，它们分别为:C点:8.4～8.9和20KD;D点:7.4～8.5，37.6～38.6KD，Le Mao的d点等电点只有7.6，本实验D点等电点比Le Mao实验的范围要大;E点:7.0～7.6，40.5～41.5KD;F点:5.3，43.8KD。本实验首次在双向电泳及其双向印迹中，证实6.5～6.9，175～180KD的过敏原组分对应于Der p14。本实验新发现5个组分:G点:6.9～7.3和90～93KD为Der p11。H点:7.1～7.5和69.7～70.7KD为Der p18。I点:9.0和14.8KD，可能为Der p5的亚型;J点:等电点为9.0，分子量小于14KD，此过敏原组分可能为大过敏原分子降解后的片段。K点:6.98～7.38，57.0～56.0KD为Der p16。结论 户尘螨过敏原双向电泳指纹图谱可同时直观显示户尘螨过敏原的等电点和分子量。Der p14的成功分离和其它新分离的过敏组分显示用Trizol液提取户尘螨可获得更多的过敏原组分。
关键词 户尘螨 过敏原 双向电泳 免疫印迹
Study on finger printing of Dermatophagoides pteronyssinus by two-dimensional immunoblotting
Sun Jinlu，Zhang Hongyu，Wang Jinglan，et al.
Department of Allergy，PUMC Hospital，CAMS&PUMC，Beijing100730.
【Abstract】 Objective To explore Dermatophagoides pteronyssinus（D.pteronyssinus）allergens finger printˉing with two-dimensional（2D）electrophoresis and2D immunoblotting.Methods D.pteronyssinus purified mite bodies（PMB）extracts were prepared with Trizol reagent.In protein concentration assay，BCA reagents were used and2D electrophoresis and2D immunoblotting technique were done with D.pteronyssinus extract and mixed sera pool.Results Identification of IgE-binding components of D.pteronyssinus（Der p）PMB with MS pool were as follows:Der p1（pI5.4，Mr=25.6KD），Der p2（pI7.6～9.0，Mr=15.2KD），Der p3（pI8.1～8.5，Mr=28.5～28.6KD），Der p4（pI6.5～7.0，Mr=61.0～62.0KD），Der p5（pI7.0～7.3，Mr=14.8KD），Der p6（pI5.8～6.1，Mr=25.5～25.8KD），Der p7（pI6.9～7.1，Mr=26.5KD），Der p8（pI6.8～7.0，Mr=24.9KD），Der p9（pI8.8，Mr=28.1KD），Der p10（pI6.5～6.8，Mr=36.4KD）。Some allergens similar to Le Mao described:C（pI8.4～8.9，Mr=20KD）;D（pI7.4～8.5，Mr=37.6～38.6KD），E（pI7.0～7.6，Mr=40.5～41.5KD）;F（pI5.3，Mr=43.8KD）.Der p14（pI6.5～6.9，175～180KD）was initially showed in2D immunoblotting in this study.We found5new componts Der p11（pI6.9～7.3，Mr=90～93KD），Der p16（pI6.98～7.38，Mr=57.0～56.0KD），Der p18（pI7.1～7.5，Mr=69.7～70.7KD），isoform of Der p5（9.0，Mr=14.8KD）.Conclusion D.pteronyssinus alˉlergens in2D finger printing could be seen their pI and Mr at the same map.In addition，Derp14and other new components immunoblotted showed that more components immunoblotted in D.pteronyssinus could be found if we exˉtract it with Trizol reagent.
Key words Dermatophagoides pteronyssinus allergen two-dimensional electrophoresis immunoblotting.
尘螨是最重要吸入物过敏原之一，尘螨过敏反应的发病率不断增加，日益受到人们重视。尘螨过敏可表现为过敏性鼻炎、过敏性哮喘、湿疹、特应性皮炎、荨麻疹、皮肤瘙痒等。因此，有关尘螨的研究一直是变态反应学的研究热点 ［1］ 。尘螨蛋白提取的方法有很多，例如:传统的Coca’s液、PBS、去垢剂等。在使用去垢剂如SDS、SB3-14（Zwittergent3-14）后，人们发现越来越多的过敏原成分 ［2，3］ 。螨的浸出液可用于特异性诊断和治疗。因此，在尘螨蛋白的提取中，尽量提取到所有的过敏原组分一直是人们最关心的问题。笔者在比较Coca’s液、裂解液及Trizol法提取户尘螨蛋白效果的基础上 ［4］ ，进一步采用双向免疫印迹研究户尘螨过敏原组分。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 纯种户尘螨螨体（Dermatophagoides pteronyssinus）购自Allergon，Inc.，ngelholm，Sweden，批号:496500901，产品质量分析检验文件号:4965
1.1.2 Trizol试剂 Gibco BRL购自美国Life Technologies公司。
1.1.3 蛋白质含量测定试剂盒 二喹啉甲酸（BCA）检测法，美国Pierce公司产品。
1.1.4 双向电泳试剂 30%丙烯酰胺（acrylamide）/甲叉双丙烯酰胺（30:0.8，2.7%C）、甘氨酸（glycine）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自Bio-Rad公司，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）、CHAPS购自Sigma公司，超纯尿素（ultra urea）、IPG缓冲液、IPG覆盖液、IPG干胶条（pH为3～10和4～7，L为7cm）、低分子量标准蛋白和Pharmalyte（pH为3～10）购自Amersham Pharmacia Biotech公司，预染的中分子量标准蛋白购自Pierce公司，二硫苏糖醇（DTT）购自Promega公司，十二烷基硫酸钠（SDS）购自日本Nacalai tesque公司，碘乙酰胺（iodoacetamide）购自Fluka公司，考马斯亮蓝R-250、PMSF购自Sigma公司，其余均为国产试剂。
1.1.5 双向电泳设备 IPGphor、附件和循环水浴、直电泳仪miniVE、mageScanner光密度仪、向电泳图象分析软件ImˉageMaster2D Elite3.01均为Amersham Pharmcia产品。
1.1.6 转印仪 美国Bio-Rad公司半干转印仪（SEMI-DRY TRANSFER CELL TRANS-BLOT SD）。
1.1.7 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 美国Bio-Rad公司。
1.1.8 转印滤纸 美国Bio-Rad公司300 # 滤纸（每张滤纸厚度约1.5mm）No930-6648。
1.1.9 X线摄影暗匣AX-II 汕头市粤华医疗器械厂。
1.1.10 阳性血清池 来自户尘螨过敏病人血清池，由20 个对户尘螨有明显过敏临床症状的病人阳性血清（经过UˉniCap系统检测sIgE为:d1为4～6级，d2为3级以下）等量混合而成，分装后储存于-40℃，临用前复温，避免再次冻溶。
1.1.11 Tris缓冲盐-吐温溶液（TBST）成分为 10mM Tris-HCl（pH7.5），150mMNaCl，0.05%Tween-20。
1.1.12 封闭液（5%BSA-TBST） 在100ml TBST中加入5g牛血清白蛋白。
1.1.13 转印缓冲液（Transfer Buffer） pH8.3成分为:25mM Tris3.03g，192mM Glycine14.4g0.0375%SDS，加超纯水至总体积900ml，用前加10%的甲醇。
1.1.14 银染试剂盒 瑞典Amersham Pharmcia公司产品。
1.1.15 一抗 上述阳性血清复温后用封闭液1:10稀释即成为一抗。
1.1.16 二抗 美国Sigma公司辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgE，购买后分装，储存于-40℃，临用前复温，用封闭液1:1000稀释。
1.1.17 化学发光试剂 购自Santa Cruz Biotechnology Inc. （Carlifonia）的Western Blotting Luminal Reagent。
1.1.18 显影液 乐凯公司显影浓缩液1:12稀释。
1.1.19 定影液 乐凯公司定影浓缩液1:7稀释。
1.2 细胞破碎和蛋白溶解 取适量的纯种户尘螨螨体，放入研钵中，加入液氮，反复冻溶4次。在研钵内反复研磨冻溶后的样品，时间约10min。
1.3 户尘螨过敏原提取 Trizol提取蛋白方法 ［5］ :将研磨后的样品按1:10比例，加入Trizol试剂，4℃高速匀浆后，进行相分离、RNA沉淀、DNA沉淀、蛋白质沉淀、漂洗蛋白质沉淀。
1.4 蛋白质含量测定 冷丙酮-20℃沉淀上清液2h，离心12000g×10min，4℃;弃去上清液，用1%SDS复溶，BCA检测法进行蛋白质含量测定。
1.5 双向电泳 有以下具体步骤（1）第一向固相pH梯度等电聚焦;（2）平衡;（3）第二向垂直平板SDS-PAGE;（4）染色:按照Amersham Pharmacia公司推荐的方法进行银染;（5）图象分析:考染或银染后利用ImageScanner光学扫描仪，在256色灰度和300dpi的分辨率下，对考染或银染的凝胶进行扫描，利用ImageMaster2D Elite3.01进行凝胶点的检测（Spot detection）、背景消减（Background subtraction）、分子量和等电点校正、归一化处理（Volume normalization）分析蛋白图谱。
1.6 双向免疫印迹 （1）免疫印迹前的准备工作:将PVDF膜浸泡在甲醇中20秒，浸泡在超纯水中2min，最后在转印液中浸泡15～20min。取Bio-Rad公司300 # 滤纸2张，按凝胶大小剪好后，在转印液中浸泡15～20min。将双向电泳凝胶在转印液中浸泡15～20min。（2）转印:由下而上，按下列顺序依次摆放:阳极板-1张滤纸-PVDF膜-凝胶-1张滤纸-阴极板，对齐，中间不留气泡。限压18V，限流0.8～1mA/cm 2 凝胶，电转印1h10min。（3）封闭PVDF膜上的免疫球蛋白结合位点:加入15ml封闭液，轻摇1h，TBST洗膜2次，每次5min。（4）一抗与靶蛋白的结合:将PVDF膜置于小脱色盒中，按1:10比例稀释混合的血清，4℃过夜孵育，TBST洗膜3次，每次5min。（5）与二抗反应:按1:1000比例稀释度，加入辣根过氧化酶标记的鼠抗人lgE的单克隆抗体。室温轻摇1h，TBST洗膜3次，每次5min。（6）化学发光:取化学发光试剂A液及B液各2ml在小脱色盒中等量混合，将PVDF膜放入盒内，让液面没过PVDF膜，轻摇脱色盒5min，然后取出PVDF膜，用保鲜膜包裹。将包裹好的PVDF膜置于X线摄影暗匣中，将剪好的X线片放在PVDF膜的上下各一张，曝片约2～5min。（7）显影和定影:将底片放入显影液，显影3～5min。然后，放入定影液定影。最后，用超纯水冲去底片表面的定影液，凉干底片。
2 结果
在Trizol法提取纯种户尘螨螨体蛋白后，经双向电泳，再双向免疫印迹，结果如下:
如图1和图2示，（2D209点）等电点和分子量分别为5.4，25.6KD的过敏原组分对应于Der p1;（2D284，285，286点）7.6～9.0，15.2KD对应于Der p2;（2D186，188点）8.1～8.5，28.5～28.6KD对应于Der p3;（2D82，84，85点）6.5～7.0，61.0～62.0KD对应于Der p4;（2D295点）7.0～7.3，14.8KD对应于Der p5;（2D210，208点）5.9～6.1，25.5～25.8KD对应于Der p6;（2D204，205点）6.9～7.1，26.5KD对应于Der p7;（2D216，218点）6.8～7.0，24.9KD对应于Der p8;（2D192点）8.8，28.1KD对应于Der p9;（2D158，159点）6.5～6.8，36.4KD对应于Der p10。与Le Mao一文比较 ［3］ （图3和图4），本实验发现了与c、d、e、f点相似特征的C、D、E、F点，它们分别为:C点:（2D254，252，250点）8.4～8.9和20KD;D点:（2D154，152，148点）7.4～8.5，37.6～38.6KD，Le Mao的d点等电点只有7.6，本实验D点等电点比Le Mao范围要大;E点:（2D135，142，141点）7.0～7.6，40.5～41.5KD;F点:（2D126点）5.3，43.8KD。
图1 Trizol试剂提取纯种户尘螨螨体蛋白双向凝胶电泳（考染扫描图）（略）
图2 纯种户尘螨螨体蛋白双向免疫印迹过敏原组份图（化学发光）（略）
本实验首次在双向电泳及其双向印迹中，证实（2D14，17，18点）6.5～6.9，175～180KD的过敏原组分对应于Der p14。Der p14的成功分离进一步显示用Trizol液提取尘螨可获得更多的过敏原组分。
本实验新发现5个组分:G点:（2D46，47，50点）6.9～7.3和90～93KD为Der p11。H点:（2D70，71，72）7.1～7.5和69.7～70.7KD为Der p18。I点:（2D301）9.0和14.8KD，可能为Der p5的亚型;J点:（2D306点）等电点9.0，分子量小于14KD，此过敏原组分可能为大过敏原分子降解的片段。K点:（2D91和96）6.98～7.38，57.0～56.0KD为Der p16。
图3 纯种户尘螨螨体蛋白与户尘螨过敏患者混合血清双向免疫印迹过敏原组分示意图（略）
图4 Le Mao粉尘螨全螨培养物双向免疫印迹过敏原组分示意图 ［3］ （略）
黑体显示粉尘螨全螨培养物与户尘螨过敏患者混合血清双向免疫印迹的过敏原组分
3 讨论
指纹图谱或指纹法（Finger Printing） ［6］ 是指用各种手段得到的作为生物实体特征性状的图案，包括:（1）电泳或层析图谱;（2）一组一个或多个的氨基酸模体，对蛋白质的保守区域测序时得到。目前，指纹图谱的研究主要局限于中药成分鉴定和蛋白质氨基酸的鉴定，本文借这一概念用于不同生物体过敏原组份的鉴定。
本研究采用的是纯种户尘螨螨体（Purified mite bodies PMB）浸液，而Le Mao一文 ［3］ 双向电泳及免疫印迹使用的是粉尘螨全培养物（whole mite cultures WMC）浸液与粉尘螨和户尘螨过敏患者混合血清免疫印迹的结果，区别主要在于:螨种和螨过敏原来源两个方面都不相同。有许多位点与他们的结果不一致是可以理解的。例如:Der p14在双向免疫印迹中的证实和我们新发现的5个过敏原组分。
尘螨的第十四组过敏原组分由Fujikawa等 ［7］ 首先从粉尘螨的cDNA文库中调出来，重组后经过免疫组化及ELISA抑制试验验证。其分子量为177KD，又叫M-177蛋白或Mag3蛋白，存在于螨体浸液中，定位于食管的周围组织、胃肠道和其它内脏器官，在哮喘病人的致敏中发挥作用;他们再用尘螨cDNA克隆重组的过敏原Mag3免疫兔产生的抗Mag3抗体，他们进一步研究 ［8］ 则发现此类过敏原组分是一种对蛋白酶敏感的过敏原，仅仅在新鲜制备的粉尘螨浸液中存在，它们降解后的产物具有更强的致敏性。
Epton等 ［9］ 也从户尘螨和埋内宇尘螨的cDNA序列中发现Der14的N-端有1650个氨基酸，它们与昆虫的apolipophorins同源，此类蛋白很难溶解于水相提取液中，主要存在于血液和淋巴的脂质转运颗粒中，它的脂质可作为增强这种过敏原免疫原性的因素发挥作用。他们 ［10］ 同样也证明:Der p14存在于脂质体和脂质转运颗粒中，仅仅存在于新鲜制备的浸液中，在水相提取时含量很少并且极易降解。对于这种疏水性的过敏原来说水相提取是不合适的。尽管这种过敏原疏水亲脂，但是，能诱导IgE的高反应性和具有T细胞的高刺激性。对于无论是过敏患者还是非过敏患者的外周血单个核细胞，这类过敏原组分对T细胞的刺激反应均比Der p2高1倍多，因此，Der p14是一类非常重要的过敏原组分，迄今为止在双向电泳和免疫印迹中还没有Der p14的报道。
Maasch等 ［11］ 曾经首次分别用IEF和SDS-PAGE比较了纯化的户尘螨螨体（Purified mite bodies PMB）和全螨培养物（whole mite cultures WMC）的区别。他们发现:（1）在IEF中，螨体蛋白在7.0至8.0有蛋白而全螨培养物则没有蛋白;在SDS-PAGE中，螨体蛋白在43KD至177KD（177KD的蛋白为Mag3）之间有蛋白而全螨培养物则没有蛋白。（2）螨体浸液的过敏原活性（allergenicity）比全螨培养物高。结合其它作者螨体单向蛋白质电泳和单向印迹 ［2，12，13］ 及Swiss-Prot蛋白质数据库质谱结果，我们认为分子量为174～178KD的过敏原组分应该是Der p14。Der p14的成功分离进一步证明Trizol提取尘螨蛋白的高效性。此外，本实验还表明双向免疫印迹的优势在于同时显示过敏原Der p14的等电点和分子量，这是分别用IEF和SDS-PAGE达不到的效果。在本实验双向电泳中虽然有几个高丰度的蛋白点，但双向免疫印迹显示它们均不是过敏原，因此，这些高丰度的点对本实验并无干扰。本实验户尘螨最常见的过敏原Der p1至Der p10，Der p14的等电点、分子量与国际免疫学联合会（IUIS）过敏原命名分会（www.allergen.org）认定命名公告的结果一致。因此，实验结果是可信的。另外，从www.allergen.org还可查得相应的氨基酸序列，因此，我们暂未进行质谱检测。
进一步分析新发现的5个过敏原组分:G点:由3个蛋白点组成，等电点和分子量分别为:6.9～7.3和90～92.6KD，而Der f11等电点和分子量分别为5.2～6.4和90～100KD，Tsai ［14］ 等则发现Der f11是糖蛋白，N-端糖基化，有4个亚型，而户尘螨中目前尚无Der p11的报道（查WWW. Allgome）。Thomas等 ［15］ 认为:Der p11可能存在，因为Tovey ［2］ 和Obrien ［16］ 的单向免疫印迹都提示户尘螨中有95-100KD左右的过敏原组分。但是，目前需要考虑的是95-100KD左右的过敏原组分是否为M-177（即Der p14）降解产生，因为一些免疫印迹未能显示M-177（即Der p14）的存在。我们的双向免疫印迹已经显示Der p14的存在;因此，G点可能为Der p11。H点:2D70，71，72等电点和分子量分别为:7.1～7.5和69.7～70.7KD;根据国际免疫学联合会（IUIS）过敏原命名分会的最新过敏原认定命名公告Der f18的分子量均为:60KD，与H点分子量在10KD范围内，因此，我们推测H点可能为Der p18。I点:2D301等电点和分子量分别为:9.0和14.8KD，可能为Der p5的亚型;J点:2D306点等电点为9.0，由于此点在最小分子量标准之下，因此，12.3KD的分子量是不精确的，只能认为它的分子量<14KD，此过敏原可能为大过敏原分子降解后的片段。K点:2D91和96蛋白点，对应的等电点和分子量分别为:6.98～7.38和57.0～56.0KD，根据国际免疫学联合会（IUIS）过敏原命名分会的最新过敏原认定命名公告Der f16 ［17］ 的分子量均为:53KD，与K点分子量很接近，因此，K点可能为Der p16。G点、H点、I点和K点的氨基酸序列有待于质谱鉴定。由于户尘螨和粉尘螨同属于尘螨属，因此，本研究有些结果与Le Mao ［3］的结果是一致的。例如:本实验也发现了与c点、d点、e点、f点相似的C点、D点、E点、F点，其相似之处体现在位置相似或等电点和分子量相近。但是，他将Der f3和Der f7位置颠倒了，他的这一结果与现在SWISS-PROT蛋白质网站公布质谱检测Der f3和Der f7等电点结果正好相反，此处有可能是他的笔误。
粉尘螨和户尘螨过敏原组分中，有许多组分 ［14，18］ 有糖基化位点，另外，由于一些过敏原组分还有氨基酸序列的多态性 ［18，19］ ，因此，双向电泳和免疫印迹中，出现了一些蛋白点成串的现象。这些成串的现象，在Le Mao ［3］ 和Tsai ［14］ 采用的粉尘螨样品中均有许多成串的过敏原组分出现;此外，Kim等采用柑桔全爪螨 ［20］ 的双向电泳和免疫印迹也有同样的现象。对于成串的现象，我们认为原因有4种:（1）蛋白质的糖基化 ［14］ ，糖基化的位点和数目不同导致它们分子量相同或非常接近，而等电点不同，从而产生许多亚型（isoˉforms）;（2）由于同一组过敏原组分的多态性导致这些同一组过敏原组分内有一个或几个氨基酸不同，从而产生变体（variants） ［14］ ;（3）这些成串的蛋白点还有可能为不同的蛋白点;（4）上述现象同时合并存在，进一步研究有待于质谱和糖基化的检测。
致谢:衷心感谢新加坡国立大学王德云高级研究员、Dr.Chew FT和Dr.Aaron Chen Angus为本实验中提供宝贵的意见和帮助!
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（收稿日期:2001-08-17）
（编辑雨 涵）
ˇ 基金项目:科技部创新药物和中药现代化基金资助（编号:2003AA2Z3502）
作者单位:100730中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院变态反应科。
100850北京放射医学研究所 △ 通讯作者:张宏誉zhy1941@yahoo.com.cn