库存血红细胞膜CR1数量和C 3 b结合率的测定

　　【摘要】 目的 分析保存不同时间的库存血红细胞膜CR1数量和C 3 b结合率的变化。方法 利用流式细胞仪（FCM）和免疫荧光抗体技术（FAT）对109份保存不同时间的库血标本进行红细胞CR1数量和C 3 b结合率测定。结果 分别为（17.04±1.81）%和（22.88±2.57）%，结果表明:随着标本保存时间的延长，CR1和C 3 b结合率都有降低，两者下降的数量不成比例，尤其是C 3 b更明显。结论 随着库存血保存时间的延长，红细胞逐渐衰老，其膜表面CR1分子数量及其C 3 b结合率减少，红细胞的免疫功能逐渐下降。
   
　　关键词 红细胞免疫 荧光抗体 补体受体
     

　　近年来，人们对红细胞免疫功能的研究越来越广泛，而红细胞膜表面的补体受体Ⅰ型CR1（Complement Receptor typeⅠ）的数量及其和补体C 3 b的结合能力是红细胞免疫功能的主要指标之一。研究表明，红细胞膜的CR1数量及C 3 b结合率的改变与许多疾病有关。我们利用流式细胞仪（FCM）和荧光抗体技术（FAT）对109例存放不同时间的库血标本分组测定，以分析红细胞免疫功能。

　　1 材料

　　1.1 标本收集 109例不同日期收集的库血标本，按常规法采集于ACD保养液中，充分混匀后将细管子分段封闭，4℃冰箱保存备用。临用前剪下一段。

     1.2 仪器 美国BD-FACSCAN型流式细胞仪

     1.3 试剂 萤光标记的兔抗人C 3 b单克隆抗体，鼠抗人CR1单克隆抗体由丹麦DAKO公司提供;萤光标记的兔抗鼠IgG1，抗体由武汉市卫生部生物制品研究所提供。临用前按效价稀释;pH7.35的PBNS、新鲜的AB型血清由本室制备。

　　2 方法

     　2.1 红细胞对C 3 b的结合率测定 将待测标本的红细胞洗涤并制成约1.0×10 10  /L，吸取100μl与等量的AB型新鲜血清混匀，37℃水浴30min，用PBNS洗涤3次，加入抗C 3 b荧光抗体200μl，37℃水浴30分钟（避光），用PBNS洗涤3次，最后留1.0ml液体，加入1%的多聚甲醛100μl固定，用自身洗涤红细胞做空白，上流式细胞仪测定。

    　2.2 红细胞膜CR1数量的测定 将待测样本的红细胞洗涤并配成约1.0×10 10  /L，吸取200μl与等量的CR1抗体试剂混匀，37℃水浴箱孵育30min，用PBNS洗涤3次，倒干，加入萤光标记的兔抗鼠IgG1抗体200μl，37°避光30min，用PBNS洗涤三次，最后留存1.0ml液体，加入1%的多聚甲醛100μl固定，用自身洗涤红细胞做空白，上流式细胞仪测定。

　　3 结果

    　109例库血标本按时间分组分别进行CR1数量和C 3 b结合率的测定，见表1。  表1 库血保存不同日期红细胞CR1和C 3 b结合率的结果略 

　　4 讨论

    　红细胞可以通过其膜表面的补体受体CR1来清除循环免疫复合物IC，并参与机体的其他免疫机制。红细胞膜表面的CR1数量减少和C 3 b结合率的降低是一种获得性现象，它与许多疾病的表现有关 ［1～5］  。研究表明，正常人14%～16%红细胞膜有补体受体CR1，而每个阳性红细胞膜表面约有50～150个CR1分子的，大多数呈簇状分布，我们通过对26例正常人（库血0天标本组）的检测，结果表明红细胞CR 1 阳性率为（17.04±2.1）%，这与国内外文献报道基本一致。但红细胞C 3 b结合率为（23.88±2.9）%;比国内的文献报道的正常范围要高 ［6］  ，主要是因为目前国内文献报道的正常参考范围多是采用酵母菌花环法，灵敏度比较低，只有那些簇状分布的CR1分子才能通过C 3 b牢固地将红细胞和酵母菌连接成花环，而那些散在的、单个分子分 布于红细胞膜表面的CR1很难形成牢固的花环，因此，容易出现假阴性。

   　 补体C 3 b是通过它分子结构的N端与红细胞膜上的CR1特异性结合，其游离的F端再与酵母多糖抗原、各种免疫复合物等进行非特异性结合，因此，用酵母菌花环法测得的C 3 b结合率就代表了红细胞膜表面的CR1数量。但事实上由于红细胞膜表面还有许多其它免疫物质 ［7］  ，这些物质的本身或通过形成免疫复合物后，能与C 3 b分子的F端非特异性结合，其游离的N端无法再与各种抗原或免疫复合物结合，因此花环法不能检出，而流式细胞仪则能比较灵敏地检出荧光标记的抗体与这些C 3 b分子的结合。所以，本实验中测得的C 3 b结合率比CR1结果高。

   　 红细胞保存的时间延长，其CR1和C 3 b结果都有下降趋势可能与红细胞的老化有关，国外已有学者利用电子显微镜观察，发现衰老的红细胞与现年轻的相比，其膜表面的CR1分子结构和序列没有改变，但分子数量要明显减少 ［8］  。另外，由于一些衰变的CR1虽然保持抗原性，但与C 3 b的结合能力却明显降低，因此我们测得的C 3 b结合率和CR1的下降数量不成比例关系。

　　参考文献

    　1 Rivas D，Riestra-Noriega.Decrease in detectable complement receptor type1levels on erythrocyte from patients with poriatic polyarthritis.Br J Rheumatol，1994，33（7）:626-630.

   　 2 Hebert La，Birmingham D J.Erythropoietin in humans increases erythroˉcyte expression of complement receptor type1（CD35）.J Am Soc Nephrol，1994，4（10）1786-1791.

    　3 贾成文.针灸对红细胞免疫的研究进展.陕西中医学院学报，2004，27（1）:22-24.

   　 4 郑善銮，于文彬，杨麦贵，等.贫血患者红细胞免疫功能的探讨，细胞与分子免疫学杂志，2003，19（6）:613.

    　5 何庭宇，雷风，粱智恒，等.癌症患者红细胞免疫粘附功能的测定分析.中华现代临床医学杂志，2003，1（10）:928-929.

　　6 郭峰.红细胞免疫十种检测方法.免疫学杂志，1990，6:60.

   　 7 郭峰.肿瘤患者RBC免疫粘附肿瘤细胞的实验与应用研究.中国免疫学杂志，1997，（13）:1.

    　8 Fishelson Z，Marikovsky Y.Reduced CR1expression on aged erythroˉcytes:immuno-eletron microscopic and functional analysis.Mech Ageˉing Dve，1993，72（1）:25-35.    

　　作者单位:1　311600浙江省建德市第一人民医院消化内科
  
　　　　　 2　310003浙江医科大学附属第一医院检验科 

     （收稿日期:2004-7-19） （编辑海 涛）