血清药理学方法研究四逆汤对离体蛙心心肌收缩力的影响

　　【摘要】 目的 观察大鼠灌胃给予四逆汤后，其含药血清对离体蛙心心肌收缩力的作用。方法 大鼠每日2次给予四逆汤（1ml/次）灌胃，给药1天后，分别在末次给药30min、60min、90min、120min取血，分离血清。将含药血清加入离体蛙心的灌流液中，观察四逆汤对离体蛙心心肌收缩力的影响。结果 灌胃给予四逆汤后，含药血清均能显著增强离体蛙心的心肌收缩力。其中末次给药后90min采血分离的血清对离体蛙心的作用最强。结论 四逆汤能增强离体蛙心的心肌收缩力。

　　Zou Xia，Yi Ping
    
　　Hunan Provincial Cancer Hospital，Changsha410006.
     
　　【Abstract】 Objective To observe the effect of Sini Decoction on the frogs’hearts in vitro.Methods The experiment was accomplished by serum pharmacology.Dosages（1ml/once）was administered to rats twice per day on one day.The blood was collected at30min，60min，90min and120min after the last administration and the serum was separated.The separated serum was added to the frogs’hearts in vitro.The influence of the separated serum on the myocardial contractility was observed.Results The separated serum from administered rats was observed to rose the amplitude of cardiac contraction markedly.The effect of serum collected at90min
 was strongest.Conclusion Sini Decoction has the effect on rosing the amplitude of cardiac contraction markedly.

　　Key words Sini Decoction serum pharmacology heart in vitro  

　　中药血清药理学方法是将动物灌服中药或复方制剂后，在一定时间内采集其血清液，分离血清以进行体外药理实验的方法。此方法于20世纪80年代由日本学者提出，90年代传入中国后，掀起了一个浪潮，并成为一个研究热点。既往的中药药理的体外实验多数运用中药粗提物直接进行实验，在方法学上存在许多问题，实验结果可信度较差。而中药血清药理学这一新型的研究方法可在某种程度上克服中药本身的理化性质等不确定因素对实验的干扰，而且相对接近药物在体内生化转化效应，实验结果可信度好。四逆汤（Sini Decoction）是东汉张仲景创制的经典名方之一，由附子（Radix Aconiti Lateralis Preparata）、干姜（Rhizoma Zingiteris）、甘草（Radix Glycyrrhizae）组成。方简效宏，具温中逐寒，回阳救逆之功。现代药理研究表明:该方具有显著的强心、增加冠脉流量和升压的作用。临床上用于治疗低血压、休克等症，其口服液被列为中医院必备急救用药。本实验采用血清药理学方法研究四逆汤对离体蛙心心肌收缩力的影响，为进一步研究四逆汤对心脏的作用机制作了初步探索。

    1 实验材料

    1.1 仪器 KMD型控温电热套（山东甄城新年仪器厂），RE-52C型旋转蒸发器（巩义市英峪予华仪器厂），BL-410生物机能实验系统（四川成都泰盟科技），JH-2型肌张力传感器（中国北京航天医学工程研究所），蛙类手术器械，蛙心夹，主动脉插管。

    1.2 动物 SD大鼠36只，青蛙58只，雌雄各半，由中南大学湘雅医学院动物实验中心提供。

    1.3 药品及试剂 附子（Radix Aconiti Lateralis Preparata）、干姜（Rhizoma Zingiteris）、甘草（Radix Glycyrrhizae）均购于中南大学湘雅附属第三医院中药房。任氏液（Ringer’s soluˉtion）每1000ml中含NaCl6.6g、KCl0.14g、NaH 2 PO 4 0.007g、CaCl 2 0.12g、NaHCO 3 0.12g、葡萄糖2.0g。

　　2 统计学方法

    利用SPSS10.0统计软件对数据进行单因素方差分析和独立t检验。当P≤0.05时，具有统计学意义。

　　3 方法与结果

    3.1 四逆汤的制备 依据中华人民共和国药典（2000版）中四逆汤的处方组成，称取附子30g，干姜20g，炙甘草30g，加水640ml回流提取2次，时间分别为2.0h和1.5h，合并提取液减压浓缩至100ml，4℃冷藏备用，（每毫升四逆汤相当于附子0.3g、干姜0.2g，炙甘草0.3g）。

    3.2 含药血清的制备 取体重（200±20）g的SD大鼠24只，随机分成4组，每组6只。灌胃给予四逆汤1ml/次，每日灌胃2次，给药1天。分别于末次给药后30min、60min、90min、120min自心脏取血6～8ml，3000r/min离心15min，分离得含药血清，于-79℃冷冻备用。

    3.3 四逆汤对离体蛙心心肌收缩力作用的影响 取体重（25±5）g的青蛙10只，常规制备蛙心，通过张力传感器连接BL-410生物机能实验系统，记录蛙心的心肌收缩力，按灌流液中四逆汤浓度由低到高依次进行实验，每次间用任氏液平衡。观察心肌收缩力的变化，结果见表1。由表1 可知，随着灌流液中四逆汤浓度的增加，离体蛙心的心肌收缩力逐渐增强。增强（%）=［给药后肌力（g）-给药前肌力（g）］/给药前肌力（g）×100%。表1 四逆汤对离体蛙心心肌收缩力的影响 （略）

　　3.4 含药血清对离体蛙心心肌收缩力作用的影响

    3.4.1 不同时间取血所得含药血清对蛙心心肌收缩力的影响 取体重（50±10）g的青蛙24只，随机分为4组，常规制备蛙心，按上法记录蛙心的心肌收缩力。待心肌收缩稳定后分别加入大鼠末次给药后30min、60min、90min、120min取血制备的含药血清，含药血清在灌流液中体积分数为10%，观察心肌收缩力的变化，以比较给药后间隔不同时间所制备含药血清对心肌收缩力影响的差异，结果见表2。由表2可知，末次给药后90min取血制备的含药血清对心肌收缩增强最为明显。

    表2 不同时间取血所得含药血清对蛙心心肌收缩力的影响 （略）

    3.4.2 不同含药血清浓度对蛙心心肌收缩力的影响 取体重（50±10）g的青蛙12只，常规制备蛙心，按上法记录蛙心的心肌收缩力。待心肌收缩稳定后，依次在灌流液中加入不同体积大鼠末次给药后90min取血制备的含药血清，每次间用任氏液平衡观察心肌收缩力的变化，结果见表3。由表3可知，含药血清对心肌收缩力的作用强度与灌流液中血清浓度呈明显的量效关系。

    表3 不同含药血清浓度对蛙心心肌收缩力的影响 （略）

    3.4.3 含药血清对离体蛙心心肌收缩力的影响 取体重（200±20）g的SD大鼠12只，随机分成2组，每组6只。第Ⅰ组为空白血清组，灌胃给予生理盐水（1ml/次）;第Ⅱ组为含药血清组，灌胃给予四逆汤（1ml/次）。以上各组每日灌胃2次，给药1天。末次给药后30min自心脏取血6～8ml，3000r/min离心15min，分离血清，于-79℃冷冻备用。

    取体重（50±10）g的青蛙12只，随机分为2组，常规制 备蛙心，按上法记录蛙心的心肌收缩力。第Ⅰ组为空白血清组，将30min取血制备的空白血清加入灌流液中，体积分数为10%。第Ⅰ组为含药血清组，将30min取血制备的含药血清加入灌流液中，体积分数同上。观察心肌收缩力的变化，结果见表4。由表4结果说明，含药血清与空白血清比较有显著增强心肌收缩力的作用（P<0.01）。

　　表4 含药血清与空白血清对心肌收缩力影响的对比 （略）

    　4 讨论

　　实验中对采血时间及灌流液中含药血清浓度进行了考察。在末次给药后30min、60min、90min、120min采血进行实验，发现给药后90min的含药血清作用最强，估计此时大鼠血液中四逆汤有效浓度最高;灌流液中不同含药血清浓度（5%、10%、15%）对离体蛙心心肌收缩力作用的影响结果表明，含药血清对心肌收缩力的作用强度与灌流液中血清浓度呈明显的量效关系，但由于含药血清量不够，未能获得完整的量效曲线。

    据文献报道，四逆汤能增强心肌收缩力，有强心作用。本实验将四逆汤直接加入蛙心灌流液中，观察心肌收缩力的变化。实验结果表明，四逆汤能明显增强心肌收缩力，且随着灌流液中四逆汤浓度的增加，离体蛙心的心肌收缩力逐渐增强。血清药理学结果表明，灌胃给予四逆汤后，含药血清也能显著增强离体蛙心的心肌收缩力。说明用血清药理学方法研究四逆汤对心肌收缩力的影响是可行的。

    运用中药粗提物直接进行体外药理时，由于存在缺乏复方体内的代谢物或机体反应物等实际有效成分，易受粗提物质的理化性质的干扰等因素，影响了实验的直接性和可靠性。中药血清药理学则可在某种程度上克服中药制剂的杂质成分、不同酸碱度、电解质等因素对反应系统的干扰，而且有利于排除体外有作用而体内没有作用的物体及发现体外没有作用而体内有作用的药物，真实的反映药物的整体作用。中药血清可用于组织细胞培养，从细胞分子水平研究中药的作用机制。

    采用含药血清进行离体实验，通常可以保留离体实验的优点，同时由于血清的理化性质与细胞所处的内环境相似，因此，在某种程度上可排除中药制剂直接离体实验所具有的难确定因素的干扰，使实验结果的可信度大大提高。血清药理学作为一种新的体外实验方法，为中药尤其是复方药理实验开辟了一条新思路，在方法学上取得了很大进展，近几年的研究显示，血清药理学目前已成为中药复方研究的重要方法，并且将发挥越来越重要的作用。

　　参考文献

    1 韩利明，刘波.淫羊藿对成骨细胞增殖的血清药理学研究.中医药学刊，2003，21（5）:678-680.

    2 周云中，孙小玉.金荞麦片的血清药理学研究-对离体豚鼠回肠的影响.中成药，1999，21（1）:34-35.

    3 杨奎，李仪奎.中药血清药理学实验方法的若干问题.中药新药与临床药理，1999，10（2）:95-98.

    4 周明眉.中药血清药理学的方法学研究-给药方案的研究.中药药理与临床，1999，15（3）:43-44.

    5 赵万红，曹永孝.中药血清药理学的方法学探讨.中药新药与临 床药理，2002，13（2）:122-124.

    6 薛洁，谢梅林.中药血清药理学的方法学研究近况.中草药，2003，34（6）:9-13.

    7 余黎，王坚.中药血清药理学研究中血清处理方法的探讨.南京中医药大学学报（自然科学版），2002，18（4）:222-223.

    8 曹俊.中药血清药理学的研究概况.中国中医药信息杂志，2002，9（1）:80-81.

    9 潘卫松，刘美凤.中药血清药理学、血清化学和中药药代动力学.世界科学技术-中药现代化.基础研究，2002，4（3）:53-56.

　10 陈长勋，金若敏.用血清药理学方法观察附子的强心作用.中国中医药科技，1996，3（3）:12-14.

    11 隋因，郭涛.运用血清药理学方法研究红花对豚鼠离体心脏的作用.沈阳药科大学学报，2003，20（5）:373-376.    

　　作者单位:410006长沙湖南省肿瘤医院药剂科 

    （收稿日期:2004-08-03） （编辑海 霞）