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【摘要】 目的 观察兔动脉粥样硬化（AS）模型中心肌细胞的凋亡现象。 方法 采用高胆固醇饮食及腹主动脉球囊拉伤的实验方法，建立兔AS模型，12周行腹主动脉血管超声检查后，处死动物，制作切片，行透射电镜观察。 结果 新西兰白兔共29只，存活24只，存活率83%。血管超声示高胆固醇组及高胆固醇加腹主动脉球囊拉伤组（以下简称干预组）腹主动脉内均可见斑块影;对照组则未见斑块影。各组兔体重差异无显著性（P>0.05）。干预组TC、TG、LDL均值明显高于对照组及实验前水平，P<0.001;而对照组实验前后TC、TG、LDL等指标差异无显著性（P>0.05）。电镜下对照组结构正常;两干预组心肌组织标本则呈现心肌细胞凋亡及心肌纤维组织增生的改变。 结论 新西兰白兔AS模型中，AS早期即尚未出现心功能障碍时，心肌细胞即出现凋亡的增多，并伴有心肌纤维化的出现，心肌细胞凋亡不仅是产生心功能减退的重要机制，心肌细胞凋亡本身很可能是心肌纤维化的诱因。
关键词 动脉粥样硬化 心肌细胞凋亡 模型
Observation of cardiomyocyte apoptosis in atherosclerotic model of rabbit
Li Mingzhe，Bu Peili，Cheng Wenqiang，et al.
Department of Cardiology，Central Hospital of Xuzhou，Jiangsu221009.
【Abstract】 Objective To explore cardiomyocyte apoptosis in physiological and pathological of atherosclero-sis.Methods A atherosclerotic model of rabbit was established by feeding hypercholesterol diet for12weeks and bal-lon injuring on ventroaorta.After12weeks，all hypercholesterolaemic rabbits were measured by blood vessel ultrasonic in older to examine atherosclerotic blocks.The left ventricular tissue was used for the observation of cell with the method of electron microscope.Results The animal liavbility was83%（24/29）in the course of researching.As a result，normal group，hypercholesterol diet group，ballon injuring on ventroaorta with feeding hypercholesterol diet group.The two latter groups were examined by blood vessel ultrasonic and showed blocks on ventroaorta.At the end of research the weight of these groups had no significant differences.The statistical figure indicate that TC，TG，LDL of hypercholesterol diet group and ballon injuring on ventroaorta with feeding hypercholesterol diet group had no signifi-cant differences with control group in the beginning of research（P>0.05）.But after research the levels of TC，TG，LDL were significant higher（P<0.001）in hypercholesterol diet group and ballon injuring on ventroaorta with feed-ing hypercholesterol diet group than before.The control group was contrary（P>0.05）.Under the electronic light microscope the control group was normal frame such as even distribution of chromatin and a normal nucleolus.In hy-percholesterol diet group and ballon injuring on ventroaorta with feeding hypercholesterol diet group under electron mi-croscope included shrinkage of nuclear volume，margination and condensation of chromatin.This result identified that the cardiac myocytes of atherosclerotic rabbits under went apoptosis.Conclusion Cardiomyocyte apoptosis occurs in atherosclerotic model of rabbits.Cardiomyocyte apoptosis is not only a main mechanism of ventricular dysfunction but also an inducement of myocardial fibrosis.
Key words atherosclerosis cardiomyocyte apoptosis model
近年来研究发现，细胞凋亡（apoptosis）在很多疾病的发生和发展中发挥着重要作用。在动脉粥样硬化（AS）斑块中亦存在着细胞凋亡的现象，在由动脉粥样硬化性心脏病等引起的心力衰竭过程中，心肌细胞凋亡是心肌细胞减少的主要原因之一 ［1］ 。已有实验研究证实并发心力衰竭的心脏有心肌细胞凋亡增加，同时伴有显著的心肌纤维化，并有残余心肌细胞肥厚等病理改变 ［2］ 。本实验采用高胆固醇饮食以及高胆固醇饮食加腹主动脉球囊拉伤手术的实验方法，建立新西兰白兔AS模型，对AS模型中心肌细胞凋亡进行观察。
1 材料与方法
1.1 实验动物 雄性新西兰白兔29只，体重（2.18±0.22）kg（由山东省农科院动物中心提供），12周后平均体重为（3.04±0.20）kg。将其随机分为正常对照组、高胆固醇饮食组（干预组 1 ）和高胆固醇饮食加腹主动脉球囊拉伤组（干预组 2 ）。实验前空腹12h，采集兔耳缘静脉血进行甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）的检测;所有实验动物处死前亦空腹12h，采血进行上述指标的检测。
1.2 试剂盒 TC、TG、LDL试剂盒，山东大学齐鲁医院中心实验室提供。
1.3 仪器 7170型日立全自动生化分析仪，JEM-1200EX型电子显微镜，HP-SONOS5500型超声诊断仪。
1.4 方法 将29只新西兰白兔随机分为正常对照组、干预组 l 、干预组 2 ，其中正常对照组9只，予标准兔饲料喂饲12周;干预组 1 10只，予99%标准兔饲料加1%胆固醇喂饲12周;干预组 2 10只，行腹主动脉球囊拉伤后，予99%标准兔饲料加1%胆固醇喂饲12周。高胆固醇饮食1周后，干预组 2 新西兰白兔，予3%戊巴比妥钠1ml/kg静脉麻醉后，参照陈纪言等 ［3］ 的方法，球囊拉伤腹主动脉。12周行腹主动脉血管超声检查后处死动物，行心肌组织透射电镜检查。
1.5 统计学方法 采用方差分析及非配对的t检验，P<0.001为差异有非常显著性。
2 结果
各组存活兔进食及营养发育状况良好，无心衰症状出现。超声检查结果:干预组均可见斑块影，正常对照组则未见斑块影。各组兔体重比较差异无显著性。实验前，各组TC、TG、LDL等血脂的各项指标差异无显著性（P>0.05）。实验后，干预组TC、TG、LDL均值明显高于对照组及实验前 水平（P<0.001）。正常对照组实验前后TC、TG、LDL等指标差异无显著性（P>0.05），见表1、表2。对照组心肌组织标本电镜下呈现正常结构:心肌细胞包膜完整，细胞核结构完整，核仁明显，内质网、线粒体及高尔基体结构清晰;心肌纤维排列整齐，可见心肌纤维规则。干预组 1 心肌组织标本则呈现心肌细胞凋亡及心肌纤维组织增生的改变，于15，000高倍镜下均可见心肌细胞体积缩小，胞质内细胞器结构不清，大量线粒体挤压、肿胀，并可见空泡化，染色质聚集靠近在核膜的周边，核仁模糊或消失;心肌纤维组织增生明显，纤维细胞增多，纤维Z带不规则甚至消失。干预组 2 心肌细胞体积显著缩小，细胞固缩，核仁模糊甚至消失，核染色质浓缩成块，凋亡小体形成，心肌胶原增生明显，心肌纤维出现断裂、自溶等，心肌细胞凋亡较前两组更加明显，凋亡细胞数明显增多。
表1 实验前后三组兔的体重 （略）
表2 三组兔血清TC、TG、LDL的变化 （略）
3 讨论
目前已经明确，内皮损伤是AS发病的重要条件 ［4］ ，内皮损伤的直接影响是血管通透性增加，脂蛋白和单核细胞进入动脉内膜，平滑肌细胞增生，吞噬脂质，形成早期的脂质条纹病变。近年来的大量研究也表明 ［5］ ，内皮损伤加上同时存在的高脂蛋白血症（甚至血脂正常）几乎毫无例外地诱发出了各种实验动物的AS病变。这种方法具有建立模型快、易于饲养、与人类早期脂肪斑块相似、经济便宜及存活率高的特点。Behr等 ［6］ 报道，用高胆固醇饮食饲养新西兰白兔8～12周，可形成类似于人类动脉脂质条纹损害的改变，饲养45周后则可形成具有成熟斑块特点的AS病变。Hayashi等 ［7］ 报道，给予新西兰白兔高胆固醇饲料10周加腹主动脉球囊拉伤可形成严重的AS病变。
本实验发现，给予新西兰白兔高胆固醇饮食12周后，干预组TC、TG、LDL均值明显高于对照组及实验前水平，P<0.001。而正常对照组实验前后TC、TG、LDL等指标差异无显著性（P>0.05）。两干预组大体标本均可见斑块分布于主动脉弓及胸主动脉，干预组 2 大体标本则可见斑块呈弥漫性分布，血管内膜几乎完全被斑块所覆盖。可见，高胆固醇饮食加上腹主动脉球囊拉伤手术的造模成功率较高，手术组动物死亡3只，手术成功率为70%，造模效果较满意。超声检查结果:两干预组腹主动脉内均可见斑块影;而正常对照组则未见斑块影。
细胞凋亡在个体的发育和自身稳定中起着十分重要的作用。但在某些疾病的病理生理过程中，发现了细胞过度凋亡现象，这说明细胞凋亡可能参与了这些疾病的发生发展过程。最近的一些研究 ［1，8］ 表明:正常心肌细胞亦存在细胞凋亡，各种损伤均可以诱导心肌细胞的凋亡，并发现在心力衰竭、高血压、扩张性心肌病、心肌梗死、缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化疾病等多种心血管疾病中，都存在着心肌细胞的过度凋亡现象。
在原发性高血压病的动物研究中，Li Z、余国龙等 ［9］ 应用末端脱氧核甘酸转换酶介导的dUTP-生物素平移末端标记（TUNEL，terminal-deoxynucleotidy transferase mediated dUTP nice end labeling）技术，对原发性高血压大鼠（SHR）的心肌进行检测后发现，在那些已经出现了心肌功能障碍的大鼠中，心肌细胞的凋亡数目明显多于无心肌功能障碍的大鼠。从而提示SHR中心肌细胞的凋亡导致了心肌细胞数的减少，因而最终导致了心力衰竭的发生。
在心力衰竭（HF）方面，有很多研究报道已证实HF的心脏确实存在着心肌细胞凋亡的现象，并证明了AngⅡ、心肌细胞内Ca 2+ 等均有促进心肌细胞凋亡的作用。
本研究发现，在AS过程中，存在着心肌细胞凋亡现象，在AS早期病变中，即出现心肌细胞的过度凋亡。张梅等 ［8］ 发现AS形成患者的血浆血管紧张素Ⅱ水平明显升高，国外学者 ［10］ 研究发现血管紧张素Ⅱ明显增加血管内皮细胞氧自由基的产生，且呈剂量依赖性，而应用氯沙坦则可明显减少氧自由基的生成。提示AS中血管紧张素水平增高与氧自由基生成关系密切，心肌细胞的过度凋亡与血管紧张素Ⅱ及氧自由基生成增加有关。在干预组 2 动物中，细胞凋亡更加明显，这可能与AS病变严重使血液中各种生物活性物质增加，继而增加心肌氧耗及心肌收缩力，继发心肌缺氧，诱发心肌细胞的凋亡有关。本研究结果提示心肌细胞凋亡是AS导致心功能障碍的原因之一。
参考文献
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8 张梅，张运，谈红，等.动脉粥样硬化与肾素血管紧张素系统及纤溶系统的关系.中国医学影像技术，2002，18:49-50.
9 余国龙，梁晓秋，谢秀梅，等.高血压大鼠心脏肥厚过程中心肌细胞凋亡心肌纤维化动态观察.高血压杂志，2001，4:322-325.
10 Warnholtz A，Nickenig G，Schulz E，et a1.Increased NADH oxidase mediated superoxide production in the early stages of atherosclerosis.evidence of involvement of the rennin angiotensin system.Circulation，1999，99（15）:2027-2033.
作者单位:1 221009江苏省徐州市中心医院心内科
2 250012济南山东大学齐鲁医院心内科
（收稿日期:2004-10-16） （编辑建 光）