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首页合作平台在线期刊中华现代临床医学杂志2005年第3卷第9期

阻断乙型肝炎病毒母婴宫内传播对血清病毒DNA和转录体影响的研究

来源:中华现代临床医学杂志
摘要:【摘要】目的进一步探讨阻断乙型肝炎病毒(HBV)母婴垂直传播的效果,明确携带HBV生育期妇女干预治疗对保护婴儿抗-HBV感染的意义。寻找乙型肝炎病毒转录体的检测在母婴传播诊断中的意义。方法224例HBsAg/HBeAg阳性孕妇分为两组,乙肝免疫球蛋白(HBIG)与左旋咪唑涂布剂治疗组154例,对照组70例。用酶联免疫吸附法(......

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  【摘要】 目的  进一步探讨阻断乙型肝炎病毒(HBV)母婴垂直传播的效果,明确携带HBV生育期妇女干预治疗对保护婴儿抗-HBV感染的意义。寻找乙型肝炎病毒转录体的检测在母婴传播诊断中的意义。 方法  224例HBsAg/HBeAg阳性孕妇分为两组,乙肝免疫球蛋白(HBIG)与左旋咪唑涂布剂治疗组154例,对照组70例。治疗组均在孕26周起开始阻断治疗。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测孕妇和新生儿血清中的HBsAg等免疫学标记物,自母亲及其婴儿血清和母亲乳汁中提取核酸,经PCR及RT-PCR分别扩增HBV-DNA和RNA,琼脂糖凝胶电泳显示产物,Southern-blotting验证反应的特异性,取代表性产物克隆、测序,检测血清HBV-DNA及全长型(fRNA)和顿挫性转录体。 结果  治疗组和对照组新生儿外周血中HBsAg、HBV-DNA、fRNA和trRNA的阳性率分别为7.1%、3.3%、3.3%、47.5%和31.4%、6.7%、13.3%、70.0%,治疗组的前三项指标明显低于对照组(P<0.01),但后一项检测指标差异无显著性(P>0.05)。HBeAg(+)母亲的HBV-DNA(75%)和fRNA的表达(65%)显著高于HBeAg(-)的母亲(P<0.05);所有表达fRNA的母亲也同时表达trRNA,在20例HBV-DNA(-)、fRNA(-)的母亲中,仍有8个可检测到trRNA。婴儿HBV-DNA(4.55%)和fRNA(6.81%)的表达较其母亲显著降低;占优势表达的是trRNA(52.27%),且与其母亲trRNA的表达状态密切相关。母亲为trRNA(+)的婴儿trRNA的表达显著高于母亲为trRNA(-)者。15例HBsAb(+)的婴儿均未检出HBV-DNA和fRNA,但11例仍可检测到trRNA。 结论  携带HBV孕妇于孕晚期给予HBIG和左旋咪唑涂布剂联合治疗后,婴儿HBsAg、HBV-DNA和fRNA携带率明显降低。然而,无论治疗组还是对照组,都有超过一半的患儿携带trRNA。与HBV-DNA及其表达产物相比,trRNA在HBV母婴垂直传播过程中有可能是一个出现更早期的可检测指标,它有助于更精确地确定新生儿HBV感染的状态。
    
  关键词  孕期干预治疗 乙型肝炎病毒 宫内传播 左旋咪唑涂布剂 乙肝免疫球蛋白 病毒转录体
     
  An observation on the vertical transmission of hepatitis B virus demonstrated by seroassays for viral transcripts,DNA and proteins
     
  Wang Qingtu,Xiu Xia,Guo Yong,et al.
   
  Weifang City Maternal and Child Health Hospital,Weifang261011.
   
  【Abstract】 Objective To further investigate the preventive effects on different intervention approaches on mother-infant vertical transmission of hepatitis B virus(HBV).To investigate the charicteristics and clinical signifi-cance of HBV transcripts(the full length and truncated RNA molecules)in transmitting from mother to infant.Meth-ods 224cases of chronic HBsAg-carriers in pregnancy were divided into two groups.154cases received anti-HBV immunoglobulin injections and levamisole liniment since the26th week of gestation;70cases did not receive the treat-ment and were regarded as a reference group.HBV seromarkers,including HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb and HB-cAb,were examined by ELISA.The viral DNA and different types of transcripts in the sera were detected using PCR and RT-PCR,respectively.The serum viral nucleic acids extracted from pairs of mother and infant were analyzed us-ing PCR and RT-PCR targetted to the HBV X protein-encoding region.Reaction specificity was confirmed by Southern blotting.Representative amplification products were cloned and sequenced.Results The seropositivity rates for HBsAg,viral DNA and full-length and truncated transcripts in babies from the treatment and reference groups were7.1%,3.3%,3.3%,47.5%and31.4%,6.7%,13.3%,70.0%,respectively,with the first four parame-ters,rather than the last one,being significantly reduced in the former group than those in the latter.The expression of XDNA(75%)and fRNA(65%)in HBeAg(+)mothers was significantly higher than that in HBeAg(-)mothers(P<0.05).All the mothers expressing fRNA expressed XDNA and trRNA at the same time.8mothers out of20were tr-RNA(+),who were both XDNA(-)and fRNA(-).The detection rate of XDNA and fRNA in infants were signifi-cantly lower than that in their mothers,whereas the detection of trRNA was high(52.27%),which was expressed su-periorly in infants serum.Infants'trRNA expression was associated closely with their mothers'that infants from trRNA(+)mothers expressed trRNA higher than those whose mother were trRNA(-).In15HBsAb(+)infants who were both XDNA(-)and fRNA(-),trRNA still can be detected in11cases.Conclusion The intervention therapy with immunoglobulin injections and levamisole liniment during pregnancy seems preventive on the vertical transmission of HBsAg,viral DNA and full-length transcripts,rather than that of the truncated viral transcripts.Compared with HBV DNA and HBV gene expressing products,trRNA might be a earlier detectable serum marker for identifying HBV infec-tion profile accurately in infants,which was associated closely with their mothers'expression of trRNA.
   
  Key words preventive intervention hepatitis B virus vertical transmission levamisole liniment HBV im-munoglobulin viral transcript
      
  孕妇携带的HBV可垂直传播感染胎儿。目前分娩时采取的一系列防范措施,尚不能完全阻止这种母婴垂直传播 [1] 。宫内感染是母婴传播的主要途径,是导致婴儿出生后乙肝疫苗(HBVac)接种失败的主要原因 [2] 。因此,阻断母婴传播是控制乙肝流行的关键环节。笔者使用HBVac、乙肝免疫球蛋白(HBIG)和左旋咪唑涂布剂(levamisole lini-ment)联合方案探讨阻断HBV宫内传播的临床疗效,取得了较好的效果。血清HBV表面抗原(HBsAg)/e抗原(HBeAg)阳性孕妇所生婴儿HBsAg阳性阻断率达80%以上 [3] 。然而,尚不知道这种干预能否完全保护婴儿免受感染,还是改变这种感染的类型 [4] 。最近建立起来的、能够识别不同3′端结构的HBV转录体血清学检测技术 [5,6] 为阐明这个问题提供了必要的手段。慢性乙型肝炎病毒感染者约1.3亿,其中有30%~50%通过母婴传播 [7] 。当孕母HBsAg阳性时,其新生儿80%~90%将感染HBV并成为慢性携带者 [8] 。母婴传播有三种途径,即宫内传播、产时传播及产后传播。大多数产后传播是由含HBV的母乳或唾液等体液中获得。
   
  我国是HBV高流行区,人群HBsAg携带率很高,大约为10.0%~15.0% [9] ,其中大部分为成年人感染。妊娠合并HBV的感染率国内外报道不一,刘芙蓉等调查7170例孕妇结果显示HBV感染率高达55.58% [10] 。慢性乙型肝炎中30%~50%是通过母婴传播形成的 [11] ,而HBsAg(+)和HBeAg(+)的母亲是高危人群,其围产期传播率平均可达85.0%,这些婴儿如果不经免疫干预,大约有90.0%的婴儿今后将成为HBsAg携带者 [12] 。虽然新生儿免疫接种已经取得了巨大的成就,但仍有部分免疫失败;有些婴儿虽已产生抗体,但并不完全处于安全状态。由于现行HBV感染的诊断方法主要局限于检测HBV-DNA及其基因产物,在感染初期不易检测到,不能及时反映其HBV基因表达的状态,对其以后HBV感染状态的监测缺乏科学的依据。近年来对RNA的研究逐渐增多,Poon [13] 等报道从妊娠妇女的血液中可检测到完全相同的胎儿的RNA,有可能通过对血液中循环RNA的分析构建基因表达的理论模式,为从RNA水平研究母婴传播问题提供例证。HBV有4个阅读框,分别称为PreS2/PreS1/S、PreC/C、聚合酶和X基因,转录为3500个核苷酸的前基因组转录体和2400及700个核苷酸的亚基因组转录体,其中最小的转录体的翻译产物称为乙型肝炎X蛋白(hepatitis B x protein,HBx),与HCC发生有关 [14~17] 。在复制期间,所有上述病毒转录体利用同一个信号成熟,这一信号位于1789位上的UAUAAA结构区 [18] ,此研究中这一类HBV转录体称为全长型RNA(full-length RNA,fRNA)。然而,整合入染色体内的病毒DNA常有HBx 阅读框3′端丢失 [19~20] ,因而fRNA的产生受到影响,转录时HBx序列与下游的细胞序列融合,形成相应的嵌合转录体和病毒/细胞融合蛋白 [21] 。另一种病毒转录体还可以利用HBx阅读框内的一个CAUAAA结构区(1661位)成熟,称为顿挫型RNA(truncated RNA,trRNA)。TrRNA存在于HCC及其周围的肝实质细胞内 [17] ,编码的顿挫型蛋白可能保持有全长HBx的生长调控作用 [22] 。继Schutz等 [23]人建立了从肝组织中检测上述两种转录体的方法后,Su和Zhang等 [24,25] 分别建立了从血清中定性和定量检测HBV-RNA的方法,其结果与肝组织进行的检测结果一致 [19] ,这一方法的建立使HBV-RNA的检测更简便易行。
   
  本研究采用上述方法,检测母婴HBsAg、HBV-DNA、fRNA、trRNA,检测HBsAg(+)/HBeAg(+)母亲及其新生儿血清中的HBV-DNA和RNA,阻断乙型肝炎病毒(HBV)母婴垂直传播的效果,明确携带HBV生育期妇女干预治疗对保护婴儿抗-HBV感染的意义,探讨乙肝病毒转录体在母婴传播中的特点及意义,为监测其感染状态提供更科学的血清学指标,并为制定有效的阻断方法提供依据。自2003年1月开始,笔者对HBsAg阳性产妇及新生儿的血清进行检测HBsAg、HBV-DNA、fRNA、trRNA,现将结果报告如下。

  1 对象与方法
    
  1.1 观察对象 HBsAg/HBeAg阳性224例系2000年1月~2004年11月期间潍坊市妇幼保健院产科连续接诊的孕20周孕妇。经孕期干预,并住院分娩进行分组观察分析。224例孕妇孕期均无先兆流产史,无急性或慢性肝炎病史,无肝功能受损情况。孕妇年龄、孕产次、胎龄均差异无显著性。224例孕妇分娩新生儿224例,其中男114例,女110例。224例按患者意愿分为治疗组(n=154)和对照组(n=70)。观察新生儿与母亲外周血中免疫学指标、HBV-DNA以及检测不同类型病毒转录体的变化,评价上述干预措施的效果。观察血清乙肝病毒标志物即乙肝五项(HBV-M)包括HBsAg及其抗体(anti-HBs)、HBeAg及其抗体(anti-HBe)和核心抗体(anti-HBc);检测的病毒转录体包括应用标准转录终止信号的全长型RNA(full-length RNA,fRNA)和隐匿终止信号的顿挫型RNA(truncated RNA,trRNA)。同时采集了治疗组44对母-婴的血清标本,母亲均为HBsAg(+),其中20例HBeAg(+);婴儿中23男21女,差异无显著性(P>0.05)。High Pure Viral Nucleic Acid Kit,核糖体RNA(rRNA),Titan One Tube RT-PCR Kit,Digoxigenin-dUTP,Anti-Digoxigenin-AP,均购自Roche公司。Ex Taq酶购自宝生物工程有限公司。ELISA试剂盒购自上海科华生物技术有限公司。
   
  1.2 治疗方法 治疗组154例:孕26周开始治疗,孕妇接受HBIG(上海生物制品研究所生产,批号为20000712)臂大肌注射,200u/月,共4次;同时使用左旋咪唑涂布剂(福建省凯华药业有限公司,批号为20000307,500mg/支)5ml涂布于上、下肢体内侧皮肤易吸收处,每周2次至分娩。对照组70例:根据患者及其亲属的意愿未给予上述任何主动或被动免疫防治措施。新生儿乙肝疫苗接种均按第0、1、6月进行。
   
  1.3 血清学检测 孕妇20~26周抽取肘静脉血2ml,新生儿分娩24h内采股静脉血2ml。分离血清,-50℃保存备用。乙肝五项检测采用ELISA法,按试剂盒(上海科华生物技术有限公司)说明进行。同时,按以前的方法[5,6] 自血清中提取病毒核酸,每次提取用血清200μl,提取物终体积为50μl。按下述方法进行PCR及RT-PCR扩增。携带乙肝病毒的产妇在产后检查静脉血、新生儿血的HBV-M、HBV-DNA。我院检验科检测乙肝病毒,采用中山生物工程有限公司提供的乙肝病毒酶联免疫诊断试剂盒,用吸附法检测乙肝病毒标志物。检测HBV-DNA采用上海复兴医疗器械公司生产FX-2500基因扩增定量分析仪检测,阴性标准为每毫升HBV-DNA<1000拷贝。
   
  1.4 病毒DNA的PCR扩增 上游引物为txs(1445):5′-GGA CCG TGT GCA CTT CGC TT-3′,下游引物为txas(1574):5′-CCT CAA GGT CGG TCG AC-3′。取2μl提取物,在含有引物对txs/txas的50μl反应体系中应用ExTag DNA聚合酶(Gibco BRL,Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)按标准条件扩增35个循环。应用fRNA的cDNA质粒pMT9T40A(200pg)和trRNA的cDNA质粒pMT9T41A(200pg)作为阳性对照,用水作为阴性对照。
   
  1.4.1 血清分离和核酸提取 孕妇26周采肘静脉血2ml,新生儿分娩后24h内采股静脉血2ml。血液采集后,30min内于40℃低温离心(4000r/m,20min)分离血清。核酸的提取采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit,按照说明书操作,仅将其中的Poly(A)RNA替换为rRNA(ribosomal RNA)作为载体RNA,以免与后面使用的Oligod(T)引物结合而干扰HBV3′端的结构分析。200μl血清可得到50μl的核酸提取物。扩增产物10μl上样到含溴化乙锭(0.2μg/ml)的琼脂糖凝胶(2%)进行电泳,紫外线下观察结果,然后将产物转移到Hybond-N+膜(Amersham,Cat.No.RPN303B)上。紫外交联后,在杂交液(5×SSC,1%Blockingregent,0.02%SDS,0.1% Laurylsarkosing)中60℃孵育2~4h后,加入探针后60℃过 夜,用洗液洗4~6遍,加抗体,显色剂显色后终止。
   
  1.4.2 探针制备 应用含有引物对txs1/xas1的PCR体系以BSX(含有HBV X片段的质粒)为模板,以地高辛(digox-in,Dig)标记的dUTP作为掺入物制备杂交探针,应用较低的掺入比(Dig-11-dUTP∶dTTP=1∶20)来证实反应产物的HBx区序列特异性。PCR条件为93℃1min40s;90℃40s;53℃50s;70℃40s;35个循环。
     
  针对HBV基因X区血清核酸的PCR、RT-PCR及探针标记所用引物见表1。
   
  1.5 fRNA和trRNA的RT-PCR检测 trRNA的RT-PCR系统采用半巢式PCR(semi-nested PCR),并在两次循环中均使用了锚定的Oligod(T)引物1683a- [24] ,分别与引物1445+和1464+配对,引物序列和位置见表1、图1。第一轮循环使用单管RT-PCR系统,按以前的方法 [20] 进行,反应体积为50μl,含模板RNA5μl,50℃20min,93℃1min40s,90℃40s;53℃50s;70℃40s;35个循环。第二轮PCR的反应体积50μl,含正反义引物各0.75μl(100ng/μl),模板cDNA5μl,条件为第一轮循环但不含逆转录过程。trRNA扩增用的锚定Oligod(T)引物与fRNA的末端1803~1806位置的结构也有一定的亲和力 [26] 。该trRNA RT-PCR系统既能识别trRNA,也能同时检测fRNA,反应条件同trRNA。为进一步显示反应的扩增效率和特异性,始终应用质粒DNA pMT9T40A和pMT9T41A进行平行扩增。前者为fRNA RT-PCR阳性而trRNA反应阴性;后者fRNA反应阴性而trRNA反应阳性 [23]。此外用去离子水作阴性对照,始终参照Kwok和Higuchi提出的原则 [26] 避免实验室内污染。所有反应至少重复一次。
    
  表1 针对HBV基因X区血清核酸的PCR、RT-PCR及探针标记所用引物(略)
   
  图1  fRNA和trRNA的RT-PCR检测目的片段示意图(略)

  1.6 逆转录后通过半巢式RT-PCR检测HBV-RNA3′端结构 我们以前的结果 [5,6] 表明,由于描定Oligo d(T)引物能够特异的扩增poly(A)RNA,检测病毒RNA的3′端结构的反应不需要Dnase I预处理标本;trRNA扩增用的Oligo d(T)引物与fRNA末端1803~1806位置的结构也有一定的亲和力,因此本研究用trRNA RT-PCR这一个反应同时显示trRNA和fRNA两种转录体分子,其产物大小分别为235bp和360bp [9] 。第一轮反应上游引物为txs;第二轮反应上游引物为txs2(1464):5′-TCA CCT CTG CAC GTC GCA TG-3′;共用锚定引物为txas5(1683):5′-(T) 15 GCT GG-3′。应用50μl单管RT-PCR系统(Roche,Mannheim,Germany)进行逆转录和扩增。为了表明血清中RNA的广泛存在和其分子的相对完整性,应用含有引物对GAPDH1/GAPDH2的RT-PCR体系对相同的标本中3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)RNA进行逆转录和扩增。所用上游引物为:GAPDH1(3755):5′-CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA-3′;下游引物为:GAPDH2(4344):5′-GGATGA CCTTGC CCA CAG CCT-3'。为了进一步显示反应的扩增效率及特异性,始终应用质粒DNA pMT9T40A和pMT9T41A进行平行扩增,前者为fRNA RT-PCR阳性而trRNA反应阴性;后者为fRNA反应阴性而trRNA反应阳性 [5,6] 。此外,去离子水和18S/22S核糖体RNA也被用来作为阴性对照,应用Kwok和Higuchi的方法 [10] 避免实验室内污染,并把所有的反应至少重复一次。
   
  血清中病毒DNA的检测见图2所示为6对母婴血清的代表性检测数据。在20例HBsAg(+)、HBeAg(+)的母亲中15例检测到XDNA;24例HBsAg(+)、HBeAg(-)母亲,9例检测到XDNA。这两种不同血清免疫学标志母亲之间XDNA的表达差异有显著性(P<0.05),e抗原阳性的母亲的XDNA表达较高。在所有44个新生儿中共检测到2例XDNA阳性,他们分别来自HBsAg(+)、HBeAg(+)、XD-NA(+)和HBsAg(+)、HBeAg(-)、XDNA(-)的母亲。新生儿XDNA的表达与其母亲的XDNA的表达与否无直接相关性(P>0.05)。无论是表面抗原阳性还是e抗原阳性的母亲,其新生儿的XDNA表达都明显减弱,两组间差异无显著性(P>0.05)(见表2)。在4例HBsAg(+)的新生儿中,只有1例XDNA阳性。
    
  表2 母婴血清免疫学标志、HBV-XDNA和转录体检测结果(略)
   
  图2  母婴血清中HBx区核酸检测的代表性数据(略)
   
  注:扩增产物经溴化乙锭染色(Eb)或Southern杂交(Hyb)显示;HBx区DNA(XDNA)、全长型(fRNA)、顿挫型(trRNA)病毒转录体分别为129bp,370bp,245bp;底部显示相应的血清学指标。A~F为母亲血清检测结果,a~f为相应婴儿的血清检测结果,G、H为阳性对照,I为阴性对照,M为DNA Marker   母亲A为HBV-DNA(+)、fRNA(+)、trRNA(+),其婴儿a为HBV-DNA(+)、fRNA(+)、trRNA(+);母亲B、C为HBV-DNA(+)、fRNA(+)、trRNA(+),其婴儿b、c为单tr-RNA(+);母亲D为HBV-DNA(+)、trRNA(+),其婴儿d为单trRNA(+);母亲E为单trRNA(+),其婴儿e为单tr-RNA(+);母亲F的HBV-DNA,全长型及顿挫型转录体均为阴性,其婴儿f为单trRNA(+)。
   
  1.7 扩增产物的检测 把产物(15μl)上样到含溴化乙锭(0.2μg/ml)的琼脂糖凝胶(2%)进行电泳,紫外线下观察,分别用UVP凝胶分析系统和光学照相记录数据,用应用软件(LabWork3.0UVP)评价产物的强度。
   
  1.8 统计学方法 按以前描述的方法 [5,6] 判定PCR和RT-PCR结果及其反应强度。计量资料采用t检验。数据使用SPSS9.0软件处理,均数资料采用χ 2 检验。

  2 结果
    
  2.1 治疗组与非治疗组孕妇所生新生儿的血清免疫学指标 治疗组共154例。孕妇均接受HBIG注射3次以及左旋咪唑涂布剂治疗3个月,治疗过程中无不良反应,足月分娩。新生儿出生后48h内、接种乙肝疫苗前采集外周血进行HBV免疫学检测,其中新生儿HBsAg阳性11例(7.1%),anti-HBs阳性27例(17.5%)。对照组70例患者均足月妊娠分娩。新生儿娩出后48h内采集外周血送检,其中HBsAg阳性22例(31.4%),anti-HBs阳性11例(15.7%)。治疗组HBsAg阳性率显著低于对照组(P<0.01,表3)。治疗组anti-HBs阳性率与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
    
  表3 预防性干预对新生儿外周血HBV-M携带率的影响(略)
   
  2.2 两组孕妇与新生儿血清中病毒转录体和DNA的检测治疗组母婴61对血清标本以及随机选取的30对对照组母婴标本进行了PCR和RT-PCR检测HBV转录体和DNA。结果见表4。
    
  表4 预防性干预对母亲及新生儿外周血HBV-DNA、fRNA和trRNA携带率的影响(略)

  对照组的30对观察对象中包括HBsAg和HBeAg阳性孕妇14例以及HBeAg已经转阴的孕妇16例。前14例中,病毒DNA强阳性者13例,fRNA强阳性者8例,trRNA阳性(+~++)13例;所生婴儿7男7女,HBsAg和HBeAg全呈阳性者4例,仅呈anti-HBc阳性者2例,HBV-M全阴性者1例,HBV-DNA阳性者1例,fRNA阳性者2例,但14例均呈trRNA阳性(+)。16例HBsAg/HBeAg阳性孕妇中,HBV-DNA阳性者5例,fRNA强阳性者2例,trRNA阳性(+~+++)者11例;所生婴儿10男6女,HBsAg阳性者2例,HBeAg/anti-HBc阳性者4例,HBV-DNA阳性1例,fRNA阳性者2例,trRNA阳性(+~++)者7例。综合本组30例新生儿的数据,HBV-DNA阳性者仅2例(6.7%),fRNA阳性者4例(13.3%),trRNA阳性者21例(70.0%)。其中2例病毒DNA阳性的新生儿血中也携带fRNA(+)和trRNA(++)。
   
  治疗组61例HBsAg阳性孕妇中,HBeAg阳性者32例,HBeAg转阴者29例。在HBeAg阳性病例中,HBV-DNA强阳性者24例,fRNA阳性(++~+++)者22例,trRNA阳性(+~++)者22例;所生婴儿14男18女,HBsAg阳性合并病毒DNA阳性者2例,HBV抗体阳性者11例,fRNA弱阳性者2例,trRNA弱阳性者22例。在HBeAg转阴的29对观察对象中,母亲呈病毒DNA阳性者6例,fRNA阳性(+++)者7例,trRNA阳性(+~+++)者9例;所生14男15女均为HBsAg阴性,病毒DNA和fRNA亦均为阴性,其中anti-HBs阳性者3例,anti-HBc阳性者6例,trRNA阳性(+~+++)者7例。综合本组61例婴儿的血清学检测结果,HBsAg阳性合并HBV-DNA阳性者2例(3.3%),fR-NA弱阳性者2例(3.3%),trRNA阳性者达31例(50.8%)。2.3 fRNA和trRNA的检测 治疗组44对母婴血清标本结果如表2所示,fRNA在HBsAg(+)、HBeAg(+)母亲中的检出率为65%,在HBsAg(+)、HBeAg(-)母亲中为20.8%,HBeAg阳性母亲的fRNA表达较高,两者差异有显著性(P<0.005)。trRNA在HBsAg(+)、HBeAg(+)母亲中的检出率为70%,在HBsAg(+)、HBeAg(-)母亲中为58.3%,两者差异无显著性(P>0.05)。所有18例表达fRNA的母亲也同时表达XDNA和trRNA,母亲XDNA的表达与fRNA关系密切(P<0.005),与trRNA的表达无直接相关性(P>0.05)。在20例XDNA(-)、fRNA(-)的母亲中,仍有8例可检测到trRNA。在44名新生儿中,3例(6.82%)检测到fRNA,其中有2例HBV-DNA阳性,两者关系密切有显著性(P<0.05);23例(52.27%)新生儿检测到trRNA。母亲XDNA、fRNA的存在状态与其新生儿相应指标之间均无直接相关性(P>0.05),见表5。但母婴之间trRNA的关系密切,母亲为trRNA(+)的婴儿trRNA的表达高于母亲为tr-RNA(-)者,差异有显著性(P<0.05),见表6。新生儿中trRNA(52.27%)的检出率明显高于fRNA(6.81%)和XDNA(4.55%),差异有显著性(P<0.005)。15例anti-HBs(+)的新生儿中检测到11例trRNA,均未检测到fRNA和HBV-DNA。

  表5 母婴HBV-XDNA和转录体血清检测结果 (略)
    
  表6 母婴trRNA血清检测结果 (略)
    
  3 讨论
    
  3.1 对HBsAg阳性孕妇行主动和被动免疫,可以有效降低宫内感染率 已有研究表明,乙肝免疫球蛋白对阻断乙肝病毒母婴传播有一定作用,孕妇产前多次注射HBIG能有效减少HBV的宫内感染 [3] 。左旋咪唑是一种非特异性免疫调节剂,主要作用于T细胞,诱导早期前T细胞分化成熟,成为功能性T细胞并可使功能失调的T细胞恢复正常,同时增强单核细胞的趋化作用和吞噬作用,激活巨噬细胞和粒细胞移动抑制因子,诱生内源性干扰素,提高免疫和病毒疗效,已经用于治疗慢性乙型肝炎 [26~28] 。本组资料中,单纯HBsAg阳性孕妇,对照组孕妇其新生儿外周血HBsAg阳性者占31.4%,而治疗组为7.1%,较前者显著降低,提示应用HBIG及左旋咪唑可明显降低HBsAg阳性的垂直传播。HBV母婴传播发生率与母体HBsAg的浓度以及是否有HBeAg有关,晚期妊娠时母亲携带较大量HBV病毒者容易传染给胎儿。有人提出HBV经胎盘感染胎儿的可能时间为孕中期或孕晚期 [29]。由此我们认为,选择孕26周以后作为开始阻断HBV垂直传播的治疗时间较恰当。
   
  在高流行区,HBV多数于围产期或幼儿期通过母-婴垂直传播,容易慢性化 [30,31] 。慢性感染早期是病毒高复制阶段,常为HBeAg阳性,血中有高水平的病毒DNA。随着血清HBeAg转阴,部分患者血中病毒DNA随之减少,感染进入低复制期,但仍然有一些患者血中有高滴度的病毒DNA,依然显示高复制状态,这种情况下发生肝癌的机会可能较大 [32] 。这种区别也可以通过fRNA量的变化反映出来,后者与病毒DNA的变化一致 [5,6] 。然而,HBeAg转阴后的上述两种情况下都可检测到trRNA,显示这种转录体的存在与病毒复制的关系不大[5,6] 。我们的观察结果表明,在上述干预治疗过程中,母亲血中fRNA与DNA水平和HBeAg阳性密切相关,这证实了Su等的观察结果 [4,5] 。值得注意的是,婴儿血清HBsAg或fRNA阳性者其母亲血清多呈HBeAg、HBV-DNA和fRNA阳性。

  3.2 尽管血清中HBsAg相对稳定,每年也有约1%~2%自然转阴 这是HBV慢性感染的更晚期阶段,称为隐匿性感染 [4] 。在某些病例,HBsAg转阴后一段时间内血液中仍存在anti-HBc [31] 。然而,大多数隐匿性感染的发生机制仍然是个谜 [4] 。而本资料中,无论在对照组还是在治疗组,母亲和婴儿血中trRNA阳性率都相当高(表4),甚至可能是HBV慢性感染的唯一标志,这也证实了苏勤等 [5,6] 提出trRNA的存在与否与上述病毒复制指标有明确相关性的结论。迄今为止,所有的HBV血清学指标中trRNA表现最稳定,适用于隐匿性HBV感染的诊断。我们的数据还提示,至少部分HBV隐匿性感染发生于围产期。是否母亲携带乙肝病毒者所生新生儿出生时检测RNA能早期发现HBV隐匿性感染 [33~35] ,并早做预防及治疗,有待深入观察。
   
  3.3 HBV可经垂直传播引起感染 这一点已经得到大家的公认,而且垂直传播是HBV重要的传播途径之一,HBV垂直传播主要包括:(1)宫内感染:可能由于胎盘撕裂,母血漏入胎儿血液循环有关;(2)产程感染:指分娩时经产道,新生儿接触或吞入含HBV的血液、羊水或分泌物;(3)产后的密切接触及母乳喂养。有人估计,我国的慢性HBsAg携带者有40%~50%是母婴传播造成的。母亲HBsAg和抗-HBe可经胎盘传播,对婴儿HBV垂直传播的诊断应进一步动态观察HBsAg或查HBV-DNA,因为新生儿在7月龄时被动接受的HBsAg可全部转阴 [18] ,如果婴儿只是被动接受HBsAg和抗HBe,而并非HBV感染,那么婴儿肝炎通常能迅速消退,值得注意的是,如果婴儿感染的是HBV前C区突变株,虽然抗-HBe阳性,但预后较差,往往表现为慢性化,甚至出现肝硬化。婴儿出生后立即肌注乙型肝炎疫苗,可阻断通过产道及密切生活接触引起的垂直传播,但对于宫内感染的HBV则几乎无效。愈蕙等 [36] 为了探讨HBV感染接种乙肝疫苗失败原因,应用间接免疫荧光技术对其中32例宫内感染HBV的婴儿进行外周血T淋巴细胞亚群测定,结果CD4 + /CD8 + 值在宫内感染HBV接种乙肝疫苗无反应组最低,他们认为小儿宫内感染HBV对其免疫状态有一定影响,宫内感染HBV接种疫苗有无效果与小儿细胞免疫功能、免疫调控系统的作用是否正常有关 [36] 。HBV垂直传播不仅表现为母婴传播,而且还可以表现为父婴传播,如果婚前母亲接种乙型肝炎疫苗免疫成功,婴儿出生后约90%获得被动anti-HBs,而且能有效地避免HBV的父婴垂直传播。
   
  3.4 我国是乙型肝炎病毒的高流行区,多数HBV感染是在围产期或者婴幼儿期通过母婴传播获得的 本研究从RNA水平初步探讨HBV母婴传播的规律,为明确母婴传播的机制提供新思路,为制定有效的阻断方法提供新的血清学指标。本研究结果显示XDNA在HBsAg(+)母亲中较高表达(54.55%),尤其是HBeAg(+)母亲,可达75%。HBV-DNA的表达和e抗原阳性有很好的一致性,这与既往的报道相符。但无论是表面抗原阳性还是e抗原阳性的母亲,HBV-DNA在其新生儿中的表达都明显减弱,两组间差异无显著性(P>0.05)。部分新生儿HBsAg(-)、HBsAb(+),但并不完全处于安全状态,或者由于病毒复制水平较低,或者由于病毒处于非复制状态,新生儿低表达的HBV-DNA不能很好地评价其HBV的感染状态。但此时HBV-DNA仍可以整合形式存在于肝组织内,并表达病毒转录体 [37] 。本研究结果表明新生儿中trRNA(52.27%)的检出率明显高于fRNA(6.81%)和XDNA(4.55%),差异有显著性(P<0.005)。提示与HBV-DNA及其表达产物相比,trRNA在HBV母婴垂直传播过程中有可能是一个出现更早期的可检测指标,它有助于更精确地确定新生儿HBV感染的状态。
   
  3.5 免疫病理和分子生物学技术 在HBsAg(+)孕妇的流产死胎肝细胞中检测到HBV标志物,证实了宫内感染的存在。以往多数报道称宫内感染率在5%~10%。近来有学者应用免疫组化、核酸分子杂交检测胎心血HBsAg、anti-HBc IgM及胎肝组织的核心抗原(HBcAg)及HBV-DNA,证明宫内感染率可达20.0%~44.4% [38] 。通常出生时HB-sAg(+)的新生儿被认为已经发生了宫内感染,HBV-DNA的检测是最直接的证据,然而在本实验中HBsAg(+)的新生儿共4例,只有1例XDNA阳性。而trRNA在大多数(52.27%)HBsAg(+)母亲所产婴儿中表达。苏勤等 [39] 的研究指出,染色体内整合的HBV-DNA可能是trRNA的主要转录模板。如果用转录体来评价,那宫内感染率将大大增加。
   
  RT-PCR/PCR的结果显示,在母亲和新生儿中,其fR-NA的存在分别与各自的XDNA的存在关系密切,而trRNA的存在不依赖于以上两者,结果与苏勤等 [39] 的研究结果基本一致。这进一步说明fRNA是病毒复制的指标,而trRNA标志着病毒持续感染状态。在母婴之间,XDNA与fRNA的存在缺乏直接相关性(P>0.05),即无论母亲是否表达XD-NA、fRNA,其婴儿均可表达相应的指标;而两者trRNA的关系密切(P<0.05),即母亲为trRNA(+)的婴儿trRNA的表达高于母亲为trRNA(-)婴儿。因此,无论是否在HBV感染的母血中检测到HBV-DNA或fRNA,都应采取积极的防治措施,尤其当母亲表达trRNA时。该结果是否说明母亲感染的整合型的HBV易于在婴儿中形成优势生长及trRNA状态是否能进一步引起HBV活动性改变有待后续动态研究证实。
   
  Anti-HBs(+)婴儿通常被认为具有保护性,但事实上并不是一种完全的非感染状态。本实验结果显示15例anti-HBs(+)的新生儿中均未检测到fRNA和XDNA,但11例仍可检测到trRNA。此时trRNA可能是唯一能检测到的标志HBV感染状态的指标,为制定有效的防治措施和评价防治效果提供了新的血清学指标。但这种感染状态的意义及转归仍需进一步进行动态观察研究。
   
  有人认为,染色体内整合的HBV-DNA可能是部分trRNA分子的转录模板 [4~6] 。我们观察到,应用HBIG及左旋咪唑可明显降低新生儿的HBsAg和病毒DNA的阳性率,但不能降低他们的trRNA携带率,与HBV-DNA及其表达产物相比,trRNA在HBV母婴垂直传播过程中有可能是一个出现更早期的可检测指标,它有助于更精确地确定新生儿HBV感染的状态。
     
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  (编辑子 涵)

  作者单位:261011山东省潍坊市妇幼保健院
   
       710038陕西西安第四军医大学唐都医院病理科

作者: 王清图修霞郭永刘兰玉牟莹莹张伟刘节崔云 2005-9-22
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