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【摘要】 目的 综述国内外对含砷化物中药(砒霜、雄黄等)及制剂的临床应用和分子药理学研究,尤其是促进肿瘤细胞凋亡的分子机制研究进展。 方法 以国内外有代表性的文献为基础进行分析、整理和归纳。结果 砷剂抗肿瘤的分子机制主要是促使PML-RARα融合蛋白降解,调节凋亡调控基因和/或蛋白的表达,巯基是砷剂诱导细胞凋亡的重要化学感受器,砷剂诱导细胞凋亡的通路主要包括半胱氨酸蛋白酶家族依赖性凋亡通路和线粒体依赖性凋亡通路。 结论 含砷化物中药及制剂治疗急性早幼粒细胞白血病疗效显著,深入研究其促进细胞凋亡的分子机制,对于有效合理使用砷剂并扩大其抗肿瘤的临床应用范围有重大意义。
关键词 三氧化二砷 雄黄 恶性血液病 细胞凋亡 信号转导
含砷化物中药及其制剂的使用在中国传统医学中有悠久的历史,近年来在治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)中取得显著疗效,在基础研究方面也取得了较大的进展。本文将综述国内外对含砷化物中药(砒霜、雄黄等)及制剂的临床应用和分子药理学研究,尤其是对于促进肿瘤细胞凋亡的分子机制研究进展,现报告如下。
1 含砷化物中药及制剂
含砷化合物的中药矿物主要包括砒石(Arsenolite)、雄黄(Realgar)和雌黄。砒石主要成分是三氧化二砷(As 2 O 3 ),分为白砒(又称砒霜,White Arsenic,为较纯的As 2 O 3 )和红砒(含有少量As 2 S 3 ) [1] 。雄黄主成分是硫化砷(As 2 S 2 或As 4 S 4 );雄黄易氧化为雌黄,雌、雄黄总成分区别在As/S比值,微量成分近似,雌黄主要成分为As 2 S 3 ,与雄黄的性状相似,但雄黄呈红色或橘红色,雌黄则为黄色[1] 。
含砒霜的制剂主要有亚砷酸钾(三氧化二砷的碱溶液)、三氧化二砷注射液、癌灵一号(内含砒石和轻粉,As 2 O 3 含量为1mg/ml,Hg 2 Cl 2 含量为0.01mg/ml)。《中国药典》(2000版)收载的含雄黄中成药有24种:七珍丸、小儿至宝丹、小儿惊风散、小儿清热片、牙痛一粒丸、牛黄抱龙丸、牛黄清心丸、牛黄解毒片、牛黄解毒丸、牛黄镇惊丸、六应丸、安宫牛黄丸、安宫牛黄散、红灵散、医痫丸、局方至宝散、阿魏化痞膏、纯阳正气丸、珠黄吹喉散、梅花点舌丸、紫金锭、暑症片、痧药、小儿化毒散等,约占药典成方总数的5.3%。还有青黄散(由雄黄、青黛、太子参、丹参等药组成)、复方青黛片(主成分为雄黄、青黛)、复方白血宁(由雄黄、黄芪、当归、苦参等药组成)等。
2 功能主治和临床应用
砒霜味辛、酸,性热,有剧毒,归肺经。外用蚀疮去腐,可治痈疽恶疮、瘰疠、痔疮等;内服劫痰平喘、劫疟、止痢,可治含痰哮喘、疟疾、痢疾 [2] 。雄黄味辛,性温,有毒,归肝、大肠经。具有燥湿、祛风、杀虫、解毒的功效。在成方中常作为辅助主药发挥清热解毒的功效而入药,如安宫牛黄丸,牛黄解毒片。含雄黄复方还常外用治疗皮肤病、小儿腮腺炎、乳痈、尖锐湿疣,疗效显著 [2,3] 。
近年来,砒霜和雄黄作为砷剂在治疗恶性血液病中取得了突出、可喜的临床疗效。孙鸿德等应用癌灵一号结合中医辨证治疗APL32例,完全缓解(CR)率达65.6%,部分缓解(PR)率12.5%,28.2%存活10年以上 [4]。张鹏等将癌灵一号简化为As 2 O 3 注射液,每日静滴10ml,28天为1个疗程,初治者30例,CR率73.3%,有效率90%;复发及难治42例,CR率53.3%,有效率64.2% [5] 。Soignet等报道用As 2 O 3 处理12例复发APL,0.06~0.2mg/(kg·d),12~39天后11例获CR [6] 。汤孝优等报道口服As 2 O 3 治疗APL,每日服用10mg或7.5mg,连用60天后,CR率分别为77.8%和62.5%,且毒副反应不明显 [7] 。其他中心应用As 2 O 3 治疗APL也取得类似良好疗效,并初步证实了As 2 O 3 与其他化疗药物,包括全反式维甲酸(ATRA),无交叉耐药性 [8,9] ,提示As 2 O 3 与以一种不依赖于维甲酸调节途径的方式发挥作用。
20世纪60年代起,周霭祥等使用青黄散治疗慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发现组方中雄黄比例越大,治疗作用越强,总结治疗CML86例,总缓解率88.4% [10] 。90年代,向阳等以复方青黛片治疗APL60例,CR率高达98.3% [11] 。白月辉等证实雄黄是复方青黛片治疗APL取得高缓解率的重要成分[12] ,陆道培等总结用雄黄或纯化雄黄治疗APL66例,均获完全缓解,认为单用雄黄治疗M 3 型白血病对初治、耐药、复发和维持缓解都有确切疗效,且纯化雄黄较原产雄黄毒副反应明显减少 [13] 。杨新中等应用复方白血宁1号治疗急慢性白血病,疗效良好 [14] 。唐由君应用含有雄黄的中成药六神丸、西黄丸、紫金锭治疗急慢性白血病也获得一定疗效 [15] 。高学熙等用雄黄治疗骨髓增生异常综合征(MDS),发现对难治性贫血伴原始细胞增多型效果明显优于难治性贫血,认为雄黄对恶性克隆增殖性疾病疗效良好 [16] 。
3 含砷化物中药及制剂的分子药理学研究进展
临床和实验研究结果提示,砷剂可从不同方面作用于肿瘤,导致肿瘤细胞凋亡、分化或抑制其增殖。对含砷中药及制剂的分子药理学研究主要围绕砷剂诱导恶性肿瘤细胞凋亡的相关基因/蛋白调控机制、信号转导途径和作用靶点展开。
3.1 促使PML-RARα融合蛋白降解 APL的特异性细胞遗传标志是染色体t(15;17)易位,导致PML基因和维甲酸(RA)受体α(RARα)基因融合,表达PML-RARα融合蛋白。PML是一种磷酸蛋白质,是线粒体(PML oncogenic domain,POD)的组成成分,具有生长抑制作用,表现为细胞周期特异性表达(S、G 2 、M期降低,G 1 期增高),诱导细胞凋亡。RARα被认为是有利于骨髓细胞分化的。PML-RARα融合蛋白致使POD的结构和功能受损,阻止了骨髓的分化和细胞凋亡,经研究证实是APL发病的主要分子基础 [17,18] 。钟璐等研究表明,在不同诱导剂(ATRA、雄黄)刺激下,PML基因在蛋白水平参与细胞终末分化和诱导白血病细胞凋亡机制,PML蛋白发挥诱导凋亡细胞控制细胞生长的作用 [19] 。研究发现,As 2 O 3 作用于NB 4 ,MR-2细胞时,0.1μmol/L As 2 O 3 即足以降解PML-RARα蛋白,蛋白的降解早于细胞凋亡 [20,21] 。经As 2 O 3 治疗的患者骨髓细胞的PML-RARα显著减少,多数获CR者其PML-RARαmRNA转阴 [6] 。朱军等研究证实As 2 O 3 的攻击点是以PML的氨基终端顺序为目标降解PML-RARα而不同于RA是以RARα为目标 [22] 。As 2 O 3 和RA联合应用与对照组比较,延长了RML-RARα转基因鼠生存,共同的通路是降解是PML-RARα融合蛋白,这为As 2 O 3 和RA的临床联合用药提供了实验依据 [23] 。
3.2 调节凋亡调控基因和/或蛋白的表达 如果As 2 O 3 仅对PML-RARα融合蛋白起作用,则只能治疗APL;但研究发现,砷剂还可以对其恶性血液病(如CML、骨髓瘤、B细胞白血病) [24,25] 和实体瘤细胞(如肝癌细胞、肺癌细胞、神经母细胞瘤、结肠癌细胞等) [26~30] ,以及其他增殖细胞(如血管平滑肌增殖细胞) [31] 有杀伤作用。多种基因参与细胞凋亡调控,其中Bcl-2基因是细胞凋亡调控的最后共同通路之一。已发现NH 4 细胞中Bcl-2、Bax、Bcl-x1及P 53 、C-myc基因大量表达。As 2 O 3 能降低NB 4 、NOP-1、NKH-1、LyH 7 细胞中Bcl-2的表达,从mRNA到蛋白质水平均有下调作用,且只有Bcl-2/Bax比例下降(这点比Bcl-2单独下调更重要),促使细胞凋亡 [32] 。陈思宇等研究发现,K562细胞低表达Bcl-2蛋白,硫化砷处理对K562细胞Bcl-2蛋白表达无明显影响,而Bax蛋白表达显著增加,使Bcl-2/Bax比例下降,从而促使细胞凋亡 [33]。
CML以BCR/ABL融合基因为遗传学特征,该基因编码BCR-ABL融合蛋白,该蛋白增强酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase,PTK)活性,激活ras等多种信号转导途径,抗细胞凋亡,研究表明BCR-ABL融合蛋白是CML发病的分子基础。As 2 O 3 可降低PTK活性,阻断BCR-ABL融合蛋白的抗凋亡信号转导,从而诱导K562细胞凋亡 [34] 。
3.3 巯基(-SH)是As 2 O 3 诱导细胞凋亡的重要化学感受器(chemosensor) 巯基是细胞重要的功能基因,砷剂易与巯基结合并使之氧化,从而启动细胞凋亡信号的产生。新近的研究表明,若实体瘤(如神经母细胞瘤)细胞内的谷胱甘肽(GSH,可使细胞内巯基含量增高,保护细胞内重要蛋白的巯基不被砷剂结合)含量低于40nmol/mg蛋白,则对As 2 O 3 敏感;若高于40nmol/mg,则不能诱导其凋亡。所以细胞内GSH含量可作为预测砷剂敏感性的指示剂。巯基还原剂———二巯基苏糖醇(dithiothreitol,DTT)可有效抑制As 2 O 3 对APL诱导凋亡效应 [35] 。伍钢等的研究表明,As 2 O 3 诱导神经母细胞瘤细胞SJ-N-SH凋亡过程中,细胞内GSH含量明显下降,处理72h后达最低点,且这种变化出现在细胞凋亡高峰(Bcl-2大量表达)发生之前 [29] 。日益增加的研究结果表明,巯基的氧化或交联是诱导细胞凋亡重要的化学基因,含有二巯基基团的蛋白质可能是As 2 O 3 作 用的主要靶分子,故巯基被认为是As 2 O 3 诱导细胞凋亡的重要化学感受器 [23] 。
3.4 半胱氨酸蛋白酶家族(Caspases)依赖性凋亡通路 有配体或受体激活的Caspases依赖性凋亡通路是化疗药物诱导细胞凋亡的主要核心通路之一。配基与受体结合,激活Caspases-8,进而激活Caspases-3和聚腺苷二磷酸—核糖多聚酶[Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]等,如干扰素、肿瘤坏死因子等均经由此通路诱导细胞凋亡 [36,37] 。在这程序激活过程中,有多药耐药性基因mdrl编码的P-糖蛋白(P-gp)抑制Caspases-8和Caspases-3的激活,因而使肿瘤多药耐药性(multidrug resistance,MDR)细胞产生凋亡抗性[38,39] 。有研究发现砷剂诱导B-细胞白血病细胞株KO-Cl 44 和LyH 7 细胞凋亡与Caspases活化有关。在1.0μmol/L As 2 O 3 诱导NB 4 细胞凋亡时,Caspases-3被激活和降解PARP,同时Bcl-2下调。在2.0μmol/As 2 O 3 诱导恶性淋巴瘤细胞凋亡时,同样可见Caspases-3被激活和PARP降解 [40] 。Caspases酶抑制剂Z-VAD.frnk可阻断As 2 O 3 诱导的细胞凋亡。说明在砷剂诱导的细胞凋亡中,Caspases酶系的激活是必需的[23] 。张晨等研究发现雄黄能诱导K562细胞凋亡,其线粒体膜APO2.7蛋白明显表达;也能诱导多药耐药细胞K562/ADM细胞凋亡,在48h后P-糖蛋白(P-gp)的表达下调 [41] ,并发现硫化砷能增加细胞膜热休克蛋白(HSP70)表达 [42] ,这一结果提示As 2 O 3 诱导细胞凋亡通路除了Caspases依赖性凋亡通路外,还有其他通路。
3.5 线粒体依赖性凋亡通路 线粒体依赖性凋亡通路是抗癌药物诱导细胞凋亡的另一核心通路。通过改变线粒体的跨膜电位等,导致细胞色素c(cytochrome-c,Cyt-c)释放,并与ATP、凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activa-tion factor-1,Apaf-1)联合作用,依次激活Caspases-9和-3、PARP等,从而导致细胞凋亡,顺铂、喜树碱等均经由此通路诱导细胞凋亡 [43] 。李艳芬等的研究表明,As 2 O 3 对喉癌细胞株KB及其耐药细胞株KBv200均有较强的细胞毒性作用,检测到As 2 O 3 作用12h后,线粒体跨膜电位稍有下降,至24h、48h后出现跨膜电位显著下降,提示线粒体跨膜电位变化在As 2 O 3 诱导细胞凋亡中起着重要作用 [44] 。
线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mtPTP)是位于线粒体内外膜交界处的蛋白复合体,调节基质pH值、离子浓度和电荷平衡,维持线粒体内环境的稳定及呼吸链正常功能。mtPTP的开放是启动细胞凋亡的重要机制,Bcl-2是凋亡的抑制蛋白,因为它是PT孔的阻断剂。研究发现As 2 O 3 治疗食管癌3天,细胞出现典型的凋亡形态学变化,用膜联蛋白V染色研究表明,食管癌细胞用As 2 O 3 治疗后2h,线粒体肿胀破坏,此变化出现在染色质凝集之前,说明As 2 O 3 诱导食管癌凋亡最初靶子是线粒体。mtPTP开放的诱导因子是活性氧(reactive oxygen species,ROS),As 2 O 3 诱导细胞凋亡也是通过ROS的产生,特别是过氧化氢(H 2 O 2 )的产生。体外研究用1μmol/L As 2 O 3 即处理NB 4 细胞可以抑制谷胱甘肽过氧化物酶(GPX),该酶是H 2 O 2 分解代谢酶,从而提高细胞内H 2 O 2 含量;若用GPX激活剂亚硒酸盐处理NB 4 细胞,H 2 O 2 耗竭,从而抑制凋亡;若同时用GPX的抑制剂MS(mercaptosuccinic acid)和过氧化氢酶抑制剂,则能显著增加As 2 O 3 的诱导凋亡作用 [23] 。贾培敏等的研究显示,0.1~0.5μmol/L As 2 O 3 即抑制多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞系生长,2.0μmol/L As 2 O 3 诱导两株细胞凋亡,并伴随线粒体跨膜电位下降和Caspase-3的激活,提示线粒体是As 2 O 3 诱导细胞凋亡的重要且共同的靶子 [45] 。
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(编辑晓 青)
* 基金项目:广东省自然科学基金资助项目(No.010270)
作者单位:510405广东广州中医药大学临床药理研究所