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系统性红斑狼疮（SLE）是一种严重危害人类健康的自身免疫性疾病，其发病原因目前尚未完全清楚。近年来的研究表明，遗传因素在SLE的发病中起决定性作用。HLA是迄今发现的最具多态性的遗传系统，与SLE有关的主要是HLA-Ⅱ类基因 ［1］ ，HLA-Ⅱ类基因座在HLA-D区，包括HLA-DQ、DR、DP3个亚区，已知HLA-DQ的多态性与SLE自身抗体的产生关系最密切 ［2］ 。最近DQ基因对自身免疫性疾病的遗传易感性已受到高度重视，我室应用微量序列特异性引物聚合酶链反应技术（Micro-PCR-SSP），探讨了广东汉族SLE患者与HLA-DQ的遗传相关性。
1 对象与方法
1.1 研究对象 拟选广东籍汉族SLE患者42例，诊断均符合1992年美国风湿病协会修订的诊断标准。男2例，女40例，年龄9～62岁，平均（32.5±6.31）岁，自愿做HLA基因分型检测。选取连续三代均为广东籍无亲缘关系的健康者110例作为对照组，男43例，女67例，年龄16～50岁，平均（31.4±8.24）岁。
1.2 标本采集 抽取SLE患者与正常人静脉血各2ml，ACD-B抗凝。
1.3 试剂 引物设计按文献 ［3］ 合成16条核苷酸链，组成12对引物。Taq酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司。DNA抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司。
1.4 基因组DNA的制备 取抗凝全血2ml3000rpm离心10min，吸取200μl白膜层加入1.5ml离心管中，加入QIA-GEN蛋白酶K25μl和AL缓冲液200μl，混匀15s，70℃孵育10min，然后加入无水乙醇200μl混匀，将上述混合液转至DNA亲和柱上，离心10000rpm1min，去除滤过液，在柱上加入AW缓冲液500μl，离心1min，重复洗涤1次，然后加入AE缓冲液200μl，室温孵育5min，最后离心1min洗脱DNA，并测定DNA的浓度和纯度。试验约耗时30min。
1.5 DNA扩增 在SSP-PCR反应体系中，每一DNA均做12支反应管，每管反应液15μl，含25μmol/L dNTP，10×PCR缓冲剂1.5μl，MgCl 2 1.5mmol/L，Taq酶1U，模板DNA50～100ng，等位基因专一性引物各0.25μmol/L。PCR循环参数为95℃1min预变性，然后95℃30s、58℃30s、72℃45s，35个循环，72℃延伸5min。扩增结束后，将扩增产物转至2%琼脂糖凝胶微量胶内，125V电压电脉15min，然后在凝胶一次性成像仪上观察并拍照。
1.6 统计学方法 用直接计数法计算基因频率。用χ 2 检验或Fisher精确法统计。P值均用Bonferroni法进行校正行校正P值（P correct，Pc），即P值乘以实验系统所检出的基因数。相对危险度（RR）用woolf法计算。显著检验水平α=0.05。
2 结果
SLE患者与正常对照组DQA1等位基因频率比较见表1。与正常对照组相比，SLE患者组中DQA1*0101等位基因频率显著升高（RR=3.12，Pc=0.036），而DQA1*0302基因频率则显著降低（RR=0.09，Pc=0.045）。
表1 SLE患者与正常对照组DQA1等位基因频率比较 （略）
3 讨论
HLA基因位于人类第6对染色体短臂，是人类基因组中目前所知的最复杂、最具多态性的遗传体系，HLA个体遗传学差异是在编码基因产物的DNA水平上，笔者采用的PCR-SSP方法就是根据HLA-DQ抗原的核苷酸序列，设计出一系列序列特异性引物，通过PCR扩增各等位基因的特异性DNA片段，进行HLA的基因分型。PCR-SSP法方便、快捷，对人体无害，易于推广，对基因多态性研究及对临床器官移植中的应用具有重要价值。
国内外近年来的研究表明，SLE中确实存在着易感的HLA-Ⅱ类等位基因，但存在种族差异。HLA-DQ多态性在自身免疫性疾病的遗传易感中的作用已受到国内外学者的高度重视。挪威的Skarsvag等发现 ［4］ 北欧白人SLE与DQA1*0501相关;黑人主要与DQA1*0401和DQA1*0501相关 ［1］ ，而日本人与DQA1*0201及DQA1*0301相关 ［1］ 。国内彭学标等 ［5］ 研究发现江苏籍汉族SLE患者与DQA1*0102、DQA1*0501相关。我们的研究发现广东籍汉族人SLE患者中DQA1*0101（RR=3.12，Pc=0.036）基因频率明显高于正常对照组，可能为SLE的易感基因，而DQA1*0302（RR=0.09，Pc=0.045）基因频率明显低于正常对照组，可能为SLE的保护基因，笔者的研究与国内外的报道有所不同。这些结果表明，不同人种SLE与HLA的关联各有特点，而同一人种不同地域也有差别，提示在遗传因素方面HLA-DQA1基因与SLE的遗传易感性关系存在着种族和人群差异。
参考文献
1 Dong RP，Kimura A，Hashimoto H，et al.Difference in HLA linked ge-netic background between mixed connective tissue disease and systemic lupus erythematosus.Tissue Antugen，1993，41（1）:20.
2 Reveille JD，Macleod MJ，Whitington K，et al.Specificamino acid re-sidues in the second hypervariable region of HLA-DQA1and HLA-DQB1chain genes promote the Ro（SS-A）/La（SS-B）autoantibody response.J Immunol，1991，146:3871.
3 O Olrup，A Aldener，A fogdell.HLA-DQB1and DQA1typing by PCR amplification with sequence-specific primers（PSR-SSP）in2hours.Tissue Antigens，1993，41:119-134.
4 Skarsvag S，Hansen KE，Holst A，et al.Distribution of HLA class alleles among Scandinavian patient with systemic lupus erythematosus.Tissue Antigen，1992，40（3）:128.
5 彭学标，徐文严，岳晓玉，等.汉族系统性红斑狼疮患者HLA-DQA1位点多态性分析.临床皮肤科杂志，1996，4:196-198.
作者单位:510120广州中医药大学附属第二临床医学院中心实验室
（编辑子 涵）