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【摘要】 目的 观察兔全脑缺血再灌（I/R）期间颈内静脉血浆ET、NO的动态变化及与脑I/R损伤的关系。方法 24只家兔随机分A、B、C三组，每组8只，C组在缺血前15min（I0）及再灌注30min（R1）、2h（R2）、4h（R3）四个时点，B组在前三个时点，A组在前两个时点采颈内静脉球部血样分别测定ET、NO及ET/NO比值的变化。取左颞皮质做HE、尼氏体染色，光镜观察，对神经元进行图像分析，测量核截面积和尼氏体平均光密度。结果 （1）NO在R1时显著增加（295%，P<0.01），在R2、R3时缓慢下降。ET在R1～R3时持续上升，由317.58ng/L升至637.01ng/L。（2）ET/NO比值在R1时与I0时差异无显著性，在R2、R3时比值显著增大，由44.83×10-6/L～224.30×10-6/L。（3）B、C组的病理损伤比A组严重，C组又比B组严重。（4）B、C组的神经元核截面比A组显著降低，C组的核截面积最小。尼氏体平均光密度A组>B组>C组。（5）ET分别与核截面积及尼氏体平均光密度呈显著负相关。ET/NO比值与核截面积及尼氏体平均光密度呈非常显著负相关。结论 （1）ET增加是脑I/R损伤的主要原因之一，ET/NO比值失衡与脑I/R损伤程度更密切。（2）应用颈内静脉血动态检测ET和NO的变化来反映脑I/R损伤程度及预后有临床实用价值。
【关键词】 内皮素；一氧化氮；脑缺血再灌；颈内静脉血；尼氏体；核截面积
内皮素（ET）和一氧化氮（NO）是近年来发现的具有广泛生物效应的细胞因子，影响机体许多生理和病理过程。两者在缺血再灌（I/R）损伤中的作用备受关注。本文旨在探讨颈内静脉血浆ET、NO变化与脑I/R损伤程度的关系，为临床判断脑I/R损伤程度提供一个简便可行的检测方法和参考数据。
1 材料与方法
1.1 手术经过和脑I/R模型的建立 实验动物在1%戊巴比妥钠30mg/kg+芬太尼10μg/kg静脉麻醉下，气管切开机械通气，保持PetCO2在35～45mmHg。全身肝素化后经股动脉置管，6导生理记录仪（Life scope 9日本光电公司）监测MAP、CVP、HR、PetCO2、ECG和鼓膜温度，利用电热毯保持鼓膜温度在37℃～39℃，经左颈内静脉逆行置管于颈静脉球处（约5cm）供采血用。按“六血管”式复制兔脑完全性缺血模型，观察期间静滴平衡液10ml/（kg·h）。
1.2 动物分组及采样时点 健康家兔24只，体重2.0～2.5kg，随机分为A、B、C三组，每组8只，缺血15min后分别再灌30min（A组）、2h（B组）和4h（C组）。C组在缺血前15min（I0）、再灌30min（R1）、2h（R2）和4h（R3）四个时点，B组在前三个时点、A组在前两个时点采血。
1.3 观察指标 （1）颈内静脉血浆ET和NO含量检测及ET/NO比值计算：在各组各时点采血4ml测定ET和NO浓度。ET测定方法按北方生物技术研究所提供的放免药盒说明书进行。NO用硝酸还原酶法测定其稳定代谢产品NO-2的水平，试剂盒由南京聚力生物医学工程研究所提供。根据测定的ET和NO数据。将各时点值分别累计，再依累计值计算ET和NO相应时点的比值。(2)组织学检查：各组在实验结束前取左颞皮层组织分别做HE、尼氏体染色，光镜观察。（3）神经元图像分析：用MPIAS-500彩色病理图文分析系统。以0.199μm像素点长，在1.09×104μm2测量窗下测神经元的核截面积。以0.389μm像素点长，在4.22×104μm2测量窗下测尼氏体的平均光密度。
1.4 统计学方法 所得数据全部输入数据库，采用统计包(SPSS 10.0)做方差分析和相关分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 颈内静脉血浆ET、NO变化 NO浓度在A组R1、B组R1及R2和C组R1、R2及R3均较同组I0升高，各组中以R1时升高显著，随着再灌时间延长，B、C组呈缓慢下降趋势。ET在A组R1，B组R1、R2和C组R1～R3均较同组I0时升高，而且B组R2的ET值＞R1，C组的ET值R3＞R2＞R1，见表1。表1 颈内静脉血浆ET、NO变化（略) 注：与I0比较，△P＜0.05； *P＜0.01
2.2 ET/NO比值变化 见表1，所列数据计算ET/NO比值，结果表明：在R2和R3时ET/NO比值同I0和R1比，差异有非常显著性，而I0和R1时的ET/NO比值无差异，见表2。随再灌注时间延长ET/NO比值成倍增大。表2 颈内静脉血浆ET/NO比值变化（略) 注：与I0、R1比较，*P＜0.01
2.3 组织学结果 A组轻度淤血、水肿，核仁清楚、核固缩较少，尼氏体呈细尘状，浅染。B组淤血、水肿，浅层部分区域核固缩，尼氏体松散、中央性尼氏体消失。C组淤血、水肿、出血明显，核固缩、深染，大部分尼氏体溶解或消失。
2.4 神经元图像分析 B、C组核截面积及尼氏体平均光密度与A组比较明显降低，其中C组下降最显著，见表3。表3 三组神经元图像分析比较（略) 注:与A组相比，△P＜0.05；*P＜0.01
2.5 相关分析 ET与核截面积及尼氏体平均光密度呈显著负相关，r值分别为-0.54和-0.67，P均＜0.05。ET/NO比值与核截面积及尼氏体平均光密度呈非常显著负相关，r值分别为-0.89和-0.94，P＜0.01。NO与核截面积及尼氏体密度无明显相关性（P＞0.05）。
3 讨论
ET和NO是一对影响血管缩舒的两大类代表性介质，二者在许多疾病中发挥重要作用，它们之间的联系在各种条件下是否始终保持平衡或各自如何依赖内在或外界条件维持平衡，目前还不十分清楚。研究表明，ET与NO的动态平衡对于脏器功能的调节至关重要［1，2］。最近有研究报道肢体缺血/再灌注后，NO与ET的比值失衡，影响脑损伤的预后［3］。但在脑I/R时两者关系如何报道不多。本文经颅内静脉球处采血排除外周静脉血稀释影响，以神经元核截面积和尼氏体平均光密度为组织形态学依据，观察ET、NO变化与脑I/R损伤关系。
在生理状态下，ET与NO之间存在负反馈调节，ET通过其B受体促进NO释放，而NO则经过CGMP途径使ET合成减少［3］，两者的合成和释放处于动态平衡，共同调节血管张力，维持组织有效的灌注。如果以I0时ET、NO浓度，ET/NO比值为基准，视二者处于平衡状态。本文在R1时三组NO增加幅度（295%）超过ET上升速度。ET/NO比值与I0时相比稍有下降，但差异无显著性，说明二者还处于平衡状态（表2）。至R2、R3时NO明显降低，ET仍持续上升，ET/NO比值比I0和R1成倍增大（表2）。NO在再灌注早期升高可以抑制白细胞和血小板聚集黏附、扩张脑血管、降低Ca2+内流、减轻缺血后“无灌注”现象，发挥保护作用［5］。但从B、C两组来看NO从R2开始不断下降，除反映其来源减少外，其拮抗ET作用或保护作用相应减弱。ET在R1～R3时呈上升趋势，它的增加除中枢神经系统自身合成和分泌外，可能还与脑I/R时血管活性因子、血管紧张素、升压素及血栓聚集和血小板素A2激活等因素有关［6］。ET/NO比值显著升高，不仅使血管舒缩向收缩方向偏移，还促使白细胞、血小板聚集黏附增强，释放一系列炎性介质，加重脑I/R损伤。B、C组核截面积及尼氏体密度比A组低，C组又比B组低（表3）。ET及ET/NO比值分别与核截面积和尼氏体密度呈显著负相关。细胞形态学损害C组＞B组＞A组。上述结果表明ET增加可能是脑I/R损伤的主要原因之一，也说明ET/NO比值失衡有更重要意义。
缺血脑组织产生的ET和NO通过血脑屏障进入血液循环，外周静脉血液由于血液循环或输液等稀释因素的影响，虽然检测外周血浆中ET、NO浓度也是一种简便易行的方法，但数据准确性不及颈内静脉血。因颈内静脉球部血液来源于脑的静脉回流，采用颈内静脉逆行置管取血样，动态观察ET、NO及ET/NO比值变化，据此判断脑I/R损伤的程度，本实验结果表明该方法是可行的。理所当然，所得数据比外周静脉血更可信，至于颈内静脉血浆中ET、NO及ET/NO比值具体变化与各种模型脑I/R关系有待进一步探讨。
【参考文献】
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3 胡永奇，张连元，李宏杰，等.一氧化氮、内皮素-1对大鼠肢体缺血/再灌注后脑损伤的影响.中国应用生理学杂志，2005，21（1）：30-32.
4 Kelly LK,Wedgwood S,Steinhorn RH,et al.Nitric oxide decreases endothlin-1 secretion through the activation of solible guanylate cyclase.Am J Physiol Lung Mol Physiol,2004,286(5):1984-1991.
作者单位： 434000 湖北荆州，荆州市第一人民医院麻醉科
(编辑：宋 青)