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【摘要】 近年来，人们对MAGE(melanoma-associated antigen)家族Ⅱ类蛋白越来越重视。对这些蛋白，尤其是Necdin和MAGE-D1，进行了一系列的研究，发现它们在神经系统的细胞周期调控、诱导细胞分化和细胞凋亡等方面具有重要的生理意义。本文对近年来MAGE家族Ⅱ类蛋白在神经系统中的生理功能的研究进展做一综述。
【关键词】 MAGE-Ⅱ类蛋白；Necdin；MAGE-D1；p75NTR；细胞凋亡
【Abstract】 Recently, the MAGE-Ⅱ proteins, especially Necdin and MAGE-D1, are coming under increasing attention because of their roles in neural development, apoptosis and cell cycle regulation. But much function of MAGE-Ⅱ proteins remain uncharacterized. Here the physiological function of MAGE-Ⅱ proteins in nervous system are briefly reviewed.
【Key words】 MAGE-Ⅱ proteins；Necdin；MAGE-D1；p75NTR；apoptosis
自从1991年发现了第一个MAGE基因［1］以来，MAGE家族被大批发现,现在至少已鉴定了25 种人类MAGE基因［2］。因为发现MAGE基因编码黑色素瘤排斥抗原，该抗原与MHC类分子特异性结合，呈递到癌细胞表面，诱导T细胞对癌细胞的特异杀伤。所以人们以前主要把研究的重点放在其对肿瘤的免疫治疗上。然而，近年来，人们发现某些MAGE蛋白能在正常组织特别是神经组织中表达，并且在细胞周期调控、细胞分化和细胞凋亡等方面具有特殊的生理意义。随着研究的深入，人们对其在神经发育和凋亡中的作用越来越重视，并有了一定的进展。尤其是对Necdin和MAGE-D1有了一定的了解。
1 MAGE家族的分类
MAGE家族基因的结构特点是含有一段MAGE保守序列（MAGE homology domain, MHD）。MAGE家族基因可根据MHD序列的相似性分为两类［3］。Ⅰ类（A－C亚群），在未分化细胞比如精细胞中表达，具有限制性表达、基因组聚集和单外显子的特点。它们编码的肿瘤排斥抗原已经被应用于肿瘤免疫治疗。Ⅱ类，在已分化细胞如神经元中表达。此类MAGE各个基因的启动子及第1外显子的序列相当多变，但C末端非常保守，该保守区域包括MHD和一个疏水跨膜区。Ⅱ类MAGE在胚胎发育过程中大量表达。Ⅱ类MAGE可根据MHD序列的相似性和蛋白分子大小，进一步分为两个亚类［4］。第一个亚类（Necdin亚类）为相对短的蛋白（<350个氨基酸残基），它们的MHD序列与Necdin更为相似，这个亚类包括：Necdin, MAGE-F1,G1和H1等。第二个亚类（MAGE-D 亚类）为相对长的蛋白（>650个氨基酸残基）。此亚类包括MAGE-D1-D4,MAGE-L2 (NDNL1)等。N-末端有延伸，包括一个约220个氨基酸的相对保守的序列，称为MHD2结构域。见表1、图1。表1 主要的MAGE Ⅱ类蛋白及其特性［3］（略） 图1（略） 主要的MAGE Ⅱ类蛋白的结构图示［3］ 人们对MAGE-Ⅱ类蛋白进行了一些研究，并有了一定的进展。特别是Necdin和MAGE-D1，下面就对这些蛋白功能的进展进行介绍。
2 Necdin
2.1 Necdin的发现和表达 1991年，Maruyama K等［5］在分化的p19胚胎癌细胞的cDNA文库中分离到一个新的cDNA序列，编码325个氨基酸的新蛋白，该蛋白在已分化神经元的细胞核中表达，命名为Necdin。Aizawa T等［6］的研究认为，Necdin几乎在所有已分化神经元的细胞核中都有分布。在成年小鼠的各脑区均可检测到Necdin mRNA，特别是下丘脑和中脑最丰富，而嗅球和小脑中的含量则较低。Niinobe M 等［7］的研究认为小鼠内源性Necdin主要定位于已分化神经元的胞质内，然后在特定的条件下转运到核内。Andrieu D等［8］对Necdin在小鼠神经发育过程中的表达进行了研究，他们发现Necdin 的RNA和蛋白在发育神经系统的所有分裂后期神经元中都有表达。从E10到E12，Necdin在所有发育的神经元中表达，包括中枢和周围神经系统，在间脑和后脑有最高表达。E13后，Necdin在神经系统特异性表达，特别是在下丘脑、丘脑和脑桥。这说明Necdin可能在这些位置起着特定的发育的作用。
2.2 Necdin的结构 Necdin蛋白就是由一个单一的MHD结构域构成，只是此结构域在C端和N端有少量不保守氨基酸序列的延长。Necdin通过MHD功能结构域与许多蛋白作用［4］，例如SV40 大T抗原，腺病毒EIA，E2F1，E2F4，p53，NEFA，p75NTR，不均一核糖核蛋白U。Taniura H等［9］发现，包含于MHD中的氨基酸序列160-280是Necdin与p53作用所必需的，144－184和191－222是Necdin靶向核基质和抑制细胞生长所必需的，同时其N端富含脯氨酸的酸性区域60－100也是抑制细胞生长所必需的。
2.3 生物学功能
2.3.1 抑制细胞生长 Necdin的异位表达能强烈地抑制增殖细胞的生长［10～12］。Necdin可与细胞转录因子E2F1的转录活性域结合［11］，抑制其推动的转录过程，从而调节与细胞周期相关蛋白的表达，抑制细胞生长。Taniura H等［13］发现,Necdin可与不均一核糖核蛋白U（hnRNP U）的C端部分作用，hnRNP U是核基质相关蛋白，与染色体DNA作用。Necdin可与其在核内形成稳定的复合物，笔者推测Necdin可能通过与hnRNP U的作用来抑制细胞增殖。
2.3.2 调控凋亡 原代培养老鼠胚胎背根神经节，对其内源性Necdin进行低表达的调控，会严重破坏神经元的成熟，同时使得凋亡细胞数增加［14］。Necdin可结合p53并抑制p53诱导的凋亡［12］。p53是已知的肿瘤抑制物，能够激活与生长停滞和凋亡相关的基因。Necdin能与它的转录活性区结合，从而阻碍p53诱导的凋亡，但对p53诱导的生长抑制没有影响。
2.3.3 与p75 NTR作用，参与NGF诱导的p75信号通路，促进神经元分化 Necdin能促进成神经瘤细胞的分化［15］。Tcherpakov M［16］等的研究则发现，Necdin能通过其MHD与p75NTR(p75 neurotrophin receptor)的胞内结构域结合，参与NGF诱导的p75信号通路。他们发现在PC12细胞内，Necdin能影响NGF诱导的p75信号通路，导致神经元分化增加。同时，在Necdin的主要表达部位也有p75和Trk受体的表达，然而在Trk A缺陷的nnr5细胞，Necdin对细胞分化没有影响，这说明p75-Necdin信号传导必须与Trk A信号通路共同作用。更为重要的是，Necdin对PC12细胞分化的影响只在NGF激活的细胞中观察到，所以推测它是NGF信号通路的后续部分。Necdin还能够自我多聚化，且定位在PC12 的胞质内，所以笔者推断Necdin可能是p75诱导的信号复合物在胞质内的接头蛋白。
2.3.4 与Fez1作用，影响轴突生长 Lee S 等［17］发现，Necdin能与Fez1 结合，阻止蛋白酶对其的降解。Fez1是一种肌纤维伸缩蛋白，参与轴突的生长和驱动蛋白介导的转运。在necdin缺陷小鼠胚胎神经系统的多个区域里出现了轴突生长和伸缩的形态学异常。这些结果都说明Necdin介导了轴突生长必需的胞内进程，它的缺失将损害轴突的生长。
2.3.5 PWS 人类Necdin基因位于15q11-13，处于Prad-er-Willi综合征（PWS）的染色体缺失区。PWS是神经出现异常引起的，其主要症状与下丘脑缺陷的症状一致。而从发育早期到成年阶段，下丘脑神经元中都有丰富的necdin基因表达。另外，necdin基因敲除鼠表现出类似PWS的症状［18］，这都说明Necdin在神经系统的正常发育中起着重要作用，它的缺失损害了神经元的分化和成熟。Necdin的缺失可能是PWS的病理原因之一。
3 MAGE-D1
3.1 MAGE-D1的发现和表达 Salehi AH 等［19］利用酵母双杂交筛选出一个新的与p75NTR作用的蛋白，命名为NRAGE（neurotrophin receptor-interacting MAGE homolog）。并发现NRAGE在整个大鼠胚胎低表达，在脑和脊髓中富集。在成年组织中表达明显降低，只在皮层和肺中能检测到。后又发现它能与转录调控因子Dlx 5作用［20］，命名为Dlxin-1，系统命名为MAGE-D1。Stephen等［21］分析了小鼠胚胎生成过程中MAGE-D1的表达，发现MAGE-D1的表达有着严格的时间的组织特异性。在CNS发育早期，它在整个神经管表达，但是在神经发生后期，它仅限于在脑室区、subplate和皮层区表达。而且MAGE-D1蛋白仅在增殖的活化的神经细胞群中表达，在这些细胞群中有着依赖于神经营养因子的凋亡，笔者推测MAGE-D1可能在神经发育过程中作为前体细胞凋亡的调控物和细胞周期进程的抑制物。
3.2 结构分析 MAGE-D1分子量为86kD。MAGE-D1除了含有MHD同源结构域外还含有一个MHD2结构域，该结构域是MAGE-D1-4和MAGE-L2共有的一段约220个氨基酸的保守序列。MHD和MHD2两个结构域被一个散布重复序列（interspersed repeat domain, IRD）隔开，该IRD由六肽WQXPXX的25个随机重复构成。
3.3 生物学功能
3.3.1 对细胞凋亡的影响 很多研究都说明MAGE-D1促进细胞凋亡，而且有着多种可能的机制。
3.3.1.1 促进p75NTR介导的凋亡 MAGE-D1能在体内外与p75NTR的胞内近膜结构域而不是死亡结构域作用。在发育的中枢神经系统，MAGE-D1 与p75NTR共定位于神经元生成的外套层，这提示着MAGE-D1可能参与神经元生长时生长停滞的调控。p75NTR是一种TNF受体，能与Trk受体结合形成复合物与神经营养因子结合，反过来激活Trk 受体。Trk A 与MAGE-D1竞争p75NTR上的同一个结合位点，所以MAGE-D1的过量表达阻碍p75NTR 与Trk A的结合,从而诱导细胞凋亡［22］。很多研究表明，p75NTR介导的信号通路，激活了JUK途径，从而诱导了凋亡。Salehi AH等［23］发现,与p75NTR作用的MAGE-D1也是通过一个JUK依赖性的线粒体通路来诱导Caspases的活化和细胞凋亡。MAGE-D1诱导细胞色素c在胞质内聚集，激活Caspases-3,-9,-7，从而诱导凋亡。而且它诱导的凋亡与JUK的非MLK依赖性激活以及c-JUK的磷酸化有关。
3.3.1.2 降解凋亡抑制蛋白，促进凋亡 MAGE-D1 可与凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis，IAP）XIAP作用［24］。XIAP通过结合激活的Caspases来抑制凋亡。而MAGE-D1-XIAP复合物能加速XIAP的降解。也就是说，MAGE-D1可能通过降解XIAP和激活Caspases来加速细胞凋亡。
3.3.1.3 与UNC5H1作用，从而诱导凋亡 Williams ME 等研究了MAGE-D1与UNC5H1的作用［25］。UNC5H1是可诱导凋亡的受体。MAGE-D1与UNC5H1共定位在多种细胞的细胞膜上，在发育神经系统的多个区域中共表达。MAGE-D1与UNC5H1的近膜区结合，该区包括一个PEST序列和一个ZU-5结构域。实验说明，UNC5H1对凋亡的调控需要其与MAGE-D1的作用。UNC5H1与p75NTR的结构有相似之处，NRMAGE与两者作用从而诱导凋亡的机制可能一致。
3.3.2 调控Dlx/Msx转录调控因子 Dlxin-1可与Dlx/Msx 家族蛋白结合，调控其转录功能［20］。Dlxin-1的散布重复序列可直接与Msx-2、Dlx-7和Dlx-5作用。Dlx/Msx 家族蛋白在颅面、四肢和神经系统的发育中起着重要的作用。Sasaki A 等［26］发现一个RING finger蛋白Prajia 1，它可与Dlxin-1的MHD结构域结合。该蛋白可能利用一个泛素依赖性降解途径来调控Dlxin-1的稳定性，从而来调节Dlx 5的转录功能。Kuwajima T 等［4］发现，Necdin 可与Msx同源蛋白作用，通过MAGE-D1来调控其功能。MAGE-D1的MHD与Necdin直接作用，而其IRD与Msx 1（或Msx 2）作用。实验证明，在体内外MAGE-D1、Necdin、Msx三者都可形成复合物。通过复合物的形成，Necdin和MAGE-D1的共表达取消了依赖于Msx的转录抑制。这说明，Necdin和MAGE-D1 共同作用来调整Dlx/Msx同源蛋白在细胞分化中的功能。受体酪氨酸激酶Ror 2 在发育形态形成中起着重要作用。Matsuda T等发现Dlxin-1的MHD与Ror 2富含脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸的胞内C末端区域作用［27］。Ror 2 不表达时，Dlxin-1与Msx 2共定位于核内，Ror 2 表达时，Dlxin-1与Ror 2共定位于膜部分，而Msx 2仍在核内。所以，Ror 2 可能通过把Dlxin-1隔离在膜部位来影响Msx 2的转录功能。另外，笔者还认为MAGE-D1在细胞内的分布可能受到Ror 2的调控。
3.3.3 与Prp（C）的作用 Bragason BT等［28］发现胞质内的Prp（C）能与NRAGE作用，在抑制蛋白酶后，内源性NRAGE在核周围聚集。重组NRAGE和Prp（C）-EGFP共定位于聚集体。在成神经瘤细胞中，NRAGE和胞质性Prp（C）的共表达影响线粒体的膜电位。研究结果表明，NRAGE和胞质性Prp（C）的相互作用可能影响神经元的存活。
4 其他MAGE-Ⅱ蛋白
4.1 MAGE-E1(DAMAGE) Douglas E 等［29］利用对α-dystrobrein的酵母双杂交鉴定出了DAMAGE（dystrobrein-ass-ociated MAGE protein）。DAMAGE在脑内高度表达，在海马神经元和浦肯野神经元的胞体和树突中都有表达。在骨骼肌中，DAMAGE位于突触后膜，与myonuclei亚组有关。DAMAGE也在周围神经中表达，它与dystrophin复合物的其他成员共定位在神经束膜和髓鞘。DAMAGE含有MHD和MHD2结构域，一个重复序列（12个氨基酸30次重复），和一个可能的核定位信号。DAMAGE可与脑的α-dystrobreind-syntrophin共沉淀。人类DAMAGE基因位于染色体Xq13.1，这个位置包含的基因与智力发育延缓有关。笔者认为DAMAGE可能在肌肉、脑及周围神经系统中起着信号传导的作用。
4.2 MAGE-G1 人类MAGE-G1基因位于近位染色体15q，这一区域与神经发育病症有关，如PWS、Angelman综合征、孤独症。Kuwako K等［30］研究发现MAGE-G1与Necdin相似：两者都可与转录因子E2F1的转录激活区作用，抑制E2F1依赖性转录，从而拮抗N1E-115成神经瘤细胞中E2F1诱导的凋亡；两者都能与p75NTR的胞内结构域作用。笔者推测MAGE-G1可能以E2F1和p75为靶作用物来调节脑发生过程中细胞的存活。
4.3 MAGE-L2 MAGE-L2的基因也位于PWS的染色体区域。MAGE-L2主要在中枢神经系统表达，特别是下丘脑、大脑皮质和脊髓，在神经发生的最高峰E15－E17有最高表达。MAGE-L2的功能仍然未知，但其组织特异性和发育表达的方式说明其与PWS有关［30］。
综上所述，可以发现在已有所研究的MAGE-Ⅱ类蛋白中有以下两个特点：(1)大部分MAGE-Ⅱ类蛋白与神经系统疾病有关，如Necdin、MAGE-E1、MAGE-G1、MAGE-L2。(2) 一些MAGE-Ⅱ类蛋白能通过其MHD与p75NTR作用，如Necdin、MAGE-D1、 MAGE-G1、MAGE-H1。这些都证明了MAGE-Ⅱ类蛋白在神经系统的发育、细胞分化、细胞周期调控和细胞凋亡等方面具有一定的生理意义。所以，对MAGE-Ⅱ类蛋白进行更深入的研究，了解它们在神经系统的作用及其机制，可以为神经系统疾病的治疗提供新的思路。
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作者单位： 100850 北京，军事医学科学院基础医学研究所
(编辑：林剑雷)