醛固酮合成酶基因多态性与高血压性脑出血的相关性研究

    【摘要】  目的  研究醛固酮合成酶（CYP11B2）基因-344T/C多态性与高血压性脑出血的关系。方法  应用多聚酶链-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，检测高血压性脑出血组132例、高血压对照组146例和正常对照组329例患者CYP11B2-344T/C基因的多态性。结果  脑出血组TC基因型的频率显著高于正常对照组，分别为37.12%和27.96%，CC基因型的频率显著高于正常对照组和高血压对照组，分别为11.36%、6.69%和5.48%；脑出血组C等位基因的频率也显著高于正常对照组和高血压对照组，分别为29.92%、20.67%和20.21%。结论  醛固酮合成酶基因-344T/C多态性与高血压性脑出血相关；C等位基因可能是中国人高血压性脑出血的一个遗传标志。

　　【关键词】  醛固酮合成酶；基因；多态性；脑出血；高血压
   
　　Association between aldosterone synthase gene polymorphism and hypertensive intracerebral hemorrhage

　　WANG Xiu-yan,YUAN Jian-xin,SONG Sheng-bin,et al.

　　Department of Neurology,Kailuan Hospital Affiliated to North China Coal Medical College,Tangshan 063000，China

　　【Abstract】  Objective  To study the relationship of aldosterone synthase (CYP11B2) gene -344T/C polymorphism and hypertensive intracerebral hemorrhage(HICH).Methods  132 patients with HICH(HICH group), 146 patients with essential hypertention(EH group) and 329 healthy subjects as normal control group were enrolled,all of whose-344T/C polymorphism of CYP11B2 gene were monitored by polymerize chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technology.Results  The proportion of TC genetype in HICH group was significantly higher than in normal control group (37.12% and 27.96%),the proportion of CC genetype in HICH group was significantly higher than in normal control group and EH group (11.36%,6.69% and 5.48%); The proportion of C allele in HICH group was 29.92%,significantly higher than in normal control group and EH group(20.67% and 20.21%).Conclusion  The -344T/C polymorphism in the CYP11B2 gene is associated with HICH in China,C allele may be a genetic marker in HICH in China.

　　【Key words】   aldosterone synthase;gene；polymorphism；hypertention；intracerebral hemorrhage

    原发性高血压是脑出血最主要的危险因素，两者之间的密切关系提示可能拥有共同的遗传易感基因。与血压水平或高血压相关的基因可能通过血压或其他途径在脑出血的病理生理过程中发挥重要作用。在此，笔者探讨了CYP11B2基因-344T/C多态性与高血压性脑出血的关系，并报告如下。

　　1  资料与方法

　　1.1  一般资料  本研究共调查607例研究对象，均为无血缘关系的华北地区汉族人群。共分为三组，其中高血压性脑出血患者（脑出血组）132例，为 2003年12月～2004年12月间开滦医疗集团神经内科的住院患者，男88例，女44例，年龄43～79岁，平均（62.35±13.29）岁；高血压对照组146例，男104例，女42例，年龄39～80岁，平均（61.90±9.45）岁；正常对照组329例，男249例，女80例，年龄37～79岁，平均（63.48±10.21）岁。经统计学检验，三组间的年龄、性别差异无显著性，三组资料匹配，具有可比性。对研究对象的CYP11B2-344基因位点进行了基因型的Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，其分布符合此平衡定律，具有群体代表性。

　　1.2  诊断标准  其诊断均符合1995年全国第四届脑血管病会议制订的高血压性脑出血的诊断标准［1］，并经头颅CT或MRI证实；单纯高血压患者（高血压对照组）146例，为我院同期的门诊及住院患者，其诊断标准符合WHO1999年制定的高血压病的诊断标准，收缩压≥140mmHg（1mmHg＝0.133kPa）和（或）舒张压≥90mmHg。正常对照组为我院同期健康查体患者。所有病例均除外既往有脑出血和脑梗死病史、肝肾功能不全、血液系统疾病以及1个月内有各种感染史者。

　　1.3  研究方法

　　1.3.1  标本采集及测定  取空腹静脉血8ml，其中3ml干燥血，离心后取血清测定相关生化指标；5ml 2%EDTA抗凝血，低渗法分离白细胞，用酚（氯仿）法提取DNA进行多态性分析。

　　1.3.2  基因型检测  引物序列：采用PCR技术对CYP11B2基因的目的片段进行扩增,上游引物为5’－CAG GAG GAG ACC CCA TGT GAC－3’，下游引物为5’－CCT CCA CCC TGT TCA GCC C－3’，引物源于北京赛百盛公司。PCR扩增体系：总反应体系25μl,其中双蒸水15.2μl，10×Buffer2.5μl，MgCl2溶液1.6μl（2.5mM），dNTP 2μl（2.5pmol/μl），上游和下游引物混合物2μl（2.5pmol/μl），TaqDNA聚合酶0.7μl(5u/μl)，模板DNA 1μl，用美国PE公司生产的PE－9700扩增仪扩增。循环条件为94℃预变性180s，后进入循环94℃预变性45s，67℃退火45s，72℃延伸60s，循环32次，后延伸72℃300s后结束反应。酶切体系：反应总体积20μl。其中双蒸水10μl，10×BufferⅡ2μl，HaeⅢ内切酶 1μl（10u/μl），PCR扩增产物7μl，37℃水浴16h。产物经2.5%的琼脂糖凝胶电泳(70v)40min,在紫外线灯下观察结果。酶切后产生202bp片段为CC型；产生273bp片段为TT型；产生202bp和273bp片段为TC型（图1）。

　　图1  CYP11B2-344T/C多态性检测的电泳结果M:标准的　略

　　1.3.3  统计学方法  用SPSS 10.0软件包进行统计学分析，以比值比（odds ratio,OR）及其95%可信区间（95%confidence interval,95%CI）表示相对危险度，用Mantel-Haenszel χ2检验基因型分布差异和相对危险度的统计学意义。计量资料以(x±s)表示，病例组与对照组间的比较采用t检验，P＜0.05有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1   临床指标测定结果  本研究分别检测了三组的收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、体重指数（BMI）、血糖（GLU）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHO）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）等临床指标，将脑出血组分别与正常对照组和高血压对照组进行比较，结果表明：脑出血组的SBP、DBP、GLU、CHO、VLDL水平显著高于正常对照组（P<0.05）；脑出血组的GLU、CHO水平显著高于高血压对照组（P＜0.05），BMI显著低于高血压对照组（P＜0.05），见表1。

　　2.2  CYP11B2-344T/C基因型、等位基因在各组中的分布

　　2.2.1  脑出血组和正常对照组各基因型、等位基因的分布  脑出血组TC和CC基因性的比率显著高于正常对照组，暴露于TC基因性的OR值为1.68（95%CI 1.08～2.67）,暴露于CC基因性的OR值为2.16（95%CI 1.06～4.39）；脑出血组C等位基因的比率显著高于正常对照组，暴露于C等位基因的OR值为1.64（95%CI 1.19～2.27），见表2。

　　2.2.2  脑出血组和高血压对照组各基因型与等位基因的分布  脑出血组只有CC基因型的比率显著高于高血压对照组，暴露于CC基因型的OR值为2.62（95%CI 1.05～6.53）；脑出血组C等位基因的频率显著高于高血压对照组，暴露于C等位基因的OR值为1.69（95%CI 1.14～2.49），见表3。

　　表1  各组间临床指标的比较  （略)

　　表2  脑出血组和正常对照组各基因型与等位基因的分布　略

　　表3  脑出血组和高血压对照组各基因型与等位基因的分布　略

　　3  讨论

　　醛固酮合成酶（CYP11B2）基因属于线粒体细胞色素p450酶超家族。定位在8q24.3，约有7千个碱基对，含有8个内含子和9个外显子。其编码蛋白为醛固酮合成酶，是醛固酮合成过程中最后一步生化反应的催化酶，具有11-β羟化酶、18-羟化酶和18-氧化酶的活性，催化脱氧皮质酮逐步生成皮质酮、18-羟皮质酮和醛固酮。CYP11B2 -344C/T是位于启动子的一个单核苷酸等位基因多态性，这个位点在该基因启动子区域-344处，恰好是类固醇生成转录因子-1（SF－1）的部位，存在C/T两种等位基因［2］。该基因多态可影响CYP11B2基因启动子与SF－1因子的结合，进而影响醛固酮合成酶mRNA的转录和醛固酮的合成分泌。

　　醛固酮是人体内重要的盐皮质激素，传统观念认为醛固酮是由肾上腺皮质球状带合成并释放入血的，但近年来的一些研究发现，除了肾上腺皮质球状带外，血管、脑、肾、肺等器官也具有合成并分泌醛固酮的功能。其中，血管合成分泌醛固酮的功能尤其引人注目。醛固酮通过促进远曲小管对钠离子的重吸收和钾离子的分泌，使钠离子排泄减少，钾离子排泄增多，这对维持机体的血压和血容量具有重要意义。血管内合成的醛固酮除了具有这些功能外，还对血管局部血流起着重要作用。Kornel等人研究发现各种体液的变化和一些神经调节能影响血管合成分泌醛固酮的量，而醛固酮量的改变又使血管平滑肌细胞膜对一些电解质的通透性发生变化，从而引起血管平滑肌紧张度的改变，这样对局部血流起到调节作用［3］。血管壁和血流动力学的改变，在急性脑血管病的发生发展中发挥着重要作用。近年来的研究表明，醛固酮可引起血管纤维化、内皮功能障碍、直接血管损害、血栓现象、压力感受器功能障碍。临床上醛固酮可能参与了高血压及卒中的病理生理过程。

　　基于醛固酮的重要生理及病理作用，近年来，关于醛固酮与高血压的相关性研究日趋增多，但CYP11B2-344T/C多态性与高血压的关系报道不一。Davies等发现高血压患者T等位基因频率显著高于非高血压患者［4］；Francois Paillard在法国人群中亦发现-344T/C多态性与-344TT基因型相关［5］；国人李庆祥等认为T等位基因可能是中国人原发性高血压的标志［6］。而Tamake 报道日本人中-344C等位基因在原发性高血压患者中出现的频率高［7］；Benetos也提示CYP11B2基因-344C等位基因与原发性高血压有关［8］。基于高血压与脑出血的密切关系，我们进行了CYP11B2-344T/C多态性与脑出血关系的研究，为鉴别基因本身是直接作用还是通过血压升高途径在脑出血的发生发展中发挥作用，本研究同时设立了正常对照组和高血压对照组，结果发现，脑出血组各基因型和等位基因的分布不仅与正常对照组之间差异存在显著性，与高血压对照组之间差异也存在显著性。与正常对照组相比，暴露于TC或CC基因型的人群发生脑出血的危险性分别是TT基因性人群的1.68和2.16倍；具有C等位基因的人群发生脑出血的危险性是T等位基因的1.64倍。而与高血压对照组相比，暴露于CC基因型的人群发生脑出血的危险性是TT基因性人群的2.62倍；具有C等位基因的人群发生脑出血的危险性是T等位基因的1.69倍。从而表明了高C等位基因在高血压性脑出血发病过程中可能具有重要作用，提示C等位基因可能是中国人群高血压性脑出血的遗传标志。该基因多态性与高血压性脑出血的关系，可能与醛固酮的生理作用及血管合成醛固酮相关，但其发病的机制尚需进一步阐明。关于CYP11B2-344T/C多态性与高血压性脑出血的关系，仍需扩大样本量进一步研究。

　　【参考文献】

　　1  中华神经科学会、中华神经外科学会.各类脑血管疾病诊断要点.中华神经科杂志，1996，29（6）：379.

　　2  Mulatero P, Schiavone D, Fallo F, et al. CYP11B2 gene polymorphisms in idiopathic hyperaldosteronism. Hypertension, 2000,35(3): 694-698.

　　3  Kornel L, Ramsay C, Kanamarlapudi N, et al. Evidence for the presence in arterial walls of intracellμlar-molecμlar mechanism for action of mineralocorticoids.Clin Exp Hypertens A，1982, 4(9-10): 1561-1582.

　　4  Davievs E, Holloway CD, Ingram MC, et al. Aldosterone excretion rate and blood pressure inessential hypertension are related to polymorphic differences in the aldosterone synthase genen CYP11B2. Hypertension, 1999,33:703-707.

　　5  Paillard F, Chansel D, Brand E, et al. Genotype-Phenotype relationships for the renin-angiotensin-aldosterone system in a normal popμlation.Hypertension, 1999, 34:423-429.

　　6  李庆祥，张宇清，靳风艳，等.醛固酮合成酶（CYP11B2）基因T（-344）C多态性与高血压病相关性研究.高血压杂志，2003, 3: 238-240.

　　7  Tamaki S, Iwai N, Tsujita Y, et al. Genetic polymorphism of CYP11B2 gene and hypertension in Japanese. Hypertension, 1999,33: 266-270.

　　8  Schmidt BW, Ceorgens AC, Martin N, et al. Enteraction of rapid nongenomic cardiovascμlar aldosterone effects with the adrenergic system. J Clin Endocrinol Metab, 2001, 86:761-767.

　　基金项目：河北省科技计划项目（项目编号：04276126）

　　作者单位：1 063000 河北唐山，华北煤炭医学院附属开滦医院神经内科

　　　　　　　2 河北唐山，开滦医疗集团范各庄矿医院神经内科

　　(编辑：魏  冉)