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【摘要】 目的 研究利用RNA干扰（RNAi）技术来逆转人白血病K562/ADM细胞多药耐药能力的可行性。方法 设计两条针对MDR1基因的发夹状RNA（shRNA），并将其分别构建在pGenSil-1质粒中；然后将这两条shRNA分别转染K562/ADM。利用罗丹明外排法、荧光定量PCR来检测这两条shRNA对K562/ADM的多药耐药性的逆转作用。结果 在稳定转染的细胞中可以观察到不同程度的MDR逆转现象。在两个稳定转染的克隆中，MDR现象被完全逆转。结论 本研究显示可以利用shRNA逆转K562/ADM细胞的多药耐药问题。
【关键词】 多药耐药；白血病；shRNA;MDR1
The complete reversal of multidrug resistance in leukemia cells by shRNA
ZHANG Xue-qin,CHEN Huan,LI Wen-yi.The Songgang People's Hospital,Bao'an District,Shenzhen 518105,China
【Abstract】 Objective To study the efficiency of reversing MDR with suppressing MDR1 gene with RNAi in K562/ADM cells.Methods For reversing MDR by RNAi technology,two different short hairpin RNAs （shRNAs） were designed and constructed into pGenSil-1 plasmid respectively.They were then transected into the highly adriamycin-resistant K562/ADM cell line.The RNAi effects on MDR was evaluated by real-time PCR,and Rhodamine123 （Rh123） efflux assay.Results The stable transfected clones showed various degrees of reversal of MDR phenotype.Surprisingly,the MDR phenotype was completely reversed in two transected clones.Conclusions This study demonstrates that MDR can be reversed by the shRNA-mediated RNAi in K562/ADM cells,which provides a valuable clue as to sensitizing multidrug-resistant hepatoma cells to anti-cancer drugs.
【Key words】 multidrug resistance;leukemia;shRNA;MDR1
多药耐药（multidrug resistance，MDR）是导致白血病化疗失败和不良预后的重要原因,克服多药耐药的方法之一是使用逆转剂［1］。但临床试验表明，这些药物很难达到一个理想的效果，主要是因为其毒副作用［2］。近年来，随着RNAi技术的发展，利用shRNA完全逆转部分肿瘤细胞的MDR现象已有报道，本文试图对这一技术用于白血病细胞的可能性进行研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料 人红白血病敏感细胞株K562及多药耐药细胞株K562/ADM均购自中国医学科学院天津血液学研究所。TRIzol Reageant试剂盒（Gibco公司），新生牛血清（Hyclone公司），DMEM高糖型细胞培养液（Gibco公司），阿霉素（法玛西亚公司）。SYBRGreen PCR Master Mix购自美国应用生物系统公司。逆转录试剂盒购自Fermentas公司。
1.2 细胞培养 细胞在37°C、5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。培养液为含10%热灭活新生牛血清的RPMI1640细胞培养液。在K562/ADM细胞的培养液中加入浓度为1.0mg/L的阿霉素以维持其耐药性。
1.3 siRNA的设计及shRNA的构建 利用siRNA设计软件（网址：http://www.sirna.qiagen.com）设计了两条序列，分别针对MDR1基因（accession number:M14758）的不同编码区域。MDR-A:5′-AAC TTT GGC TGC CAT CAT CCA -3′;MDR-B:5′- AAG GCC TAA TGC CGA ACA CAT-3′,分别针对MDR1 mRNA的第586-606及第3494-3514核苷酸区域。这两个序列分别被构建到一段短的双链DNA序列中（武汉晶赛公司合成，表1）。目的序列作为反义链，其正义链与反义链互补，中间间隔一段长9个核苷酸的发夹环，两端分别插入终止序列及Hind Ⅲ或BamH1酶切位点。然后将这两个序列分别插入pGenSil-l（武汉晶赛公司,图1）质粒中。反应按武汉晶赛公司建议的操作流程进行。
表1 shRNA寡核苷酸片断的序列 （略）
图1 pGenSil-l质粒的结构。pGenSil-l质粒 （略）
1.4 细胞转染及稳定转染克隆的筛选 当K562/ADM细胞在六孔板内达到50%~60%满时进行转染。具体操作步骤按Lipofectamine 2000TM说明书建议的操作步骤进行。细胞转染48h后，将细胞转入直径10cm的培养板中并加入含400μg/ml G418的培养液（不含阿霉素）进行培养。3周以后，将稳定转染的克隆挑入96孔板中并扩增。期间利用荧光显微镜进行观察，稳定转染的克隆发绿色荧光；而没有稳定转染的细胞没有绿色荧光，丢弃这一部分细胞。
1.5 P-gp泵功能检测 为了观察转染细胞的RNAi效果,利用Rh123（Sigma,MO,USA）外排法来检测转染细胞的P-gp泵功能，具体操作方法如Broxterman等［3］所述。简而言之，当细胞在6孔板内达到70%~80%满时，加入Rh123，其在培养液中的作用浓度为0.20μg/ml，37°C孵育1h，然后将细胞用4°C PBS漂洗3遍后重悬于4°C PBS中，细胞浓度为5~10×105/ml。上流式细胞仪（Becton dickinson immune cytometry systems）检测10000个细胞内的Rh123荧光强度。激发波长为488nm。每次试验时利用没有加入Rh123的K562细胞作为空白对照。通过计算在M1区域细胞的百分比来鉴定细胞的P-gp泵功能，落在该区域细胞的百分比越高，则该种细胞的P-gp泵功能越强。
1.6 总RNA的提取及逆转录反应 在细胞达融合生长的六孔板（此时每个孔的细胞数量大约为1×106个）中加入1.0ml TRIzol Reagent，按其说明书建议的操作步骤提取总RNA，再用DNA酶去除基因组DNA。电泳证实，具有清晰18S和28S条带的RNA用于逆转录试验。利用Fermentas公司逆转录试剂盒合成cDNA,具体操作按试剂盒说明书中的建议进行。cDNA产物-20°C保存。
1.7 荧光定量PCR检测 内参照GAPDH引物参见［4］。MDR1上游引物为5′-TGG TTC AGG TGG CTC TGG AT-3′,下游引物为5′-CTG TAG ACA AAC GAT GAG CTA TCA CA-3′。反应利用美国应用生物系统公司试剂盒SYBRGreen PCR Master Mix进行。在每个20 μl反应体系中包含SYBRGreen PCR Master Mix 10μl，上下游引物各900nM，cDNA 0.8μl。每种样本设三个重复孔。反应在美国应用生物系统公司7000型荧光定量PCR仪上进行。数据分析利用该仪器的相对定量分析软件进行。利用比较CT法测定mRNA的相对表达程度，以K562细胞的MDR1/GAPDH比值为校正样本，其值设为1，log101=0.00。
1.8 统计学方法 数据统计学分析采用非配对t检验法，在统计软件SPSS 11.0上进行。荧光定量PCR结果的统计学分析在ABI PRISM 7000荧光定量PCR仪自带的分析软件上进行，可信限设定为95%。
2 结果
2.1 shRNA抑制了P-gp泵功能 我们总共检测了48个pGenSil-1/MDR-A转染的克隆，68个 pGenSil-1/MDR-B转染的克隆及10个空pGenSil-1质粒转染克隆的P-gp泵活性。有两个pGenSil-1/MDR-B-转染克隆的P-gp泵活性被抑制到与K562细胞相近的水平，我们将其命名为KB克隆1及KB克隆2，超过60%的pGenSil-1/MDR-B转染克隆的P-gp泵活性在很大程度上被抑制（43/68），但是有5个克隆的P-gp泵活性没有被显著地抑制。pGenSil-1/MDR-A转染的细胞克隆的RNAi效果较差，没有P-gp活性被完全抑制的细胞克隆。空pGenSil-l质粒转染细胞克隆的P-gp则没有被明显地抑制（图2）。
2.2 shRNA降低了MDR1 mRNA水平 为了进一步证实Rh123外排法的测定结果，我们利用荧光定量PCR技术检测转染细胞克隆的MDR1 mRNA 的表达水平。我们分别检测了K562细胞， K562/ADM细胞 KB克隆1、KB克隆2及一个空质粒转染的克隆的MDR1 mRNA表达水平。结果显示：KB克隆1、KB克隆2的MDR1 mRNA水平明显降低，与K562/ADM细胞相比，其MDR1 mRNA分别下降了93%及92%，而空质粒转染的细胞克隆MDR1 mRNA的表达水平仅下降了40% （图3）。
3 讨论
化疗是治疗白血病的一个主要手段。目前，尽管不断有新的化疗药物和化疗方案推出，但白血病细胞对多种化疗药物产生的多药耐药性仍是化疗失败的主要原因，至今仍为治疗白血病的一大难题。有学者利用中药、反义寡核苷酸、核酶等技术来逆转MDR，但因效率低、专一性不强、使用量大等缺点，效果不甚理想。本研究应用最新的基因封闭方法RNAi技术来抑制K562/ADM细胞的MDR1基因表达。
siRNA具有抑制作用强、稳定性高等优点，正逐渐取代反义核酸,成为新的研究热点［5］。哺乳动物细胞诱导RNAi的关键在于如何有效合成siRNA。目前,化学合成的siRNA费用较高、抑制作用短暂等缺点,限制了其应用和推广，而能够稳定表达siRNA的shRNA正被逐步推广。
我们针对K562/ADM细胞的MDR1基因设计相应的特异序列，连接到带有人U6启动子的pGenSil-1质粒载体上，能够产生稳定而强大的RNAi效应，且克服了化学合成siRNA成本高,效应时间短的缺点。同时，pGenSil-1质粒是在pEGFP-C1的基础上构建的，它具有绿色荧光蛋白表达，非常方便导入效果的检测，这克服了有些载体不能及时检测导入效果的缺点。
图3 利用实时定量RT-PCR技术检测shRNA介导的MDR1 mRNA沉默效应。 （略）
本试验所应用的两条shRNA显示了不同的RNAi效果， pGenSil-1/MDR-B对 K562/ADM细胞的MDR1基因具有良好的基因沉默效果，甚至有两个克隆显示了完全的逆转效应，而pGenSil-1/MDR-A则效果较差。荧光定量RT-PCR及Rh123外排试验表明，空pGenSil-l质粒转染的K562/ADM细胞的MDR1基因表达水平有轻微的下降。这可能是因为其培养液内长期没有加入阿霉素。Budworth等［6］曾经报道，如果将多药耐药细胞长期置于不含化疗药的培养液中培养，其MDR1基因的表达水平就会下降。
总之，本研究显示，利用shRNA介导的RNA干扰技术能将具有很高耐药性的K562/ADM细胞的多药耐药性完全逆转。本研究中所采用的针对MDR1基因的siRNA序列对多药耐药的白血病细胞可能有效。将来，这一序列可以被导入基因治疗的载体中并用于临床治疗人白血病的多药耐药问题。
【参考文献】
1 Annu A,Kavita S,Yogeshwer S,et al.Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by diallyl sulfide in K562 leukemic cells and in mouse liver.Carcinogenesis，2004，25:941-949.
2 Gottesman MM,Fojo T,Bates SE.Multidrug resistance in cancer:role of ATP-dependent transporters.Nat Rev Cancer，2002，2（1）:48-58.
3 Broxterman HJ,Sonneveld P,Feller N,et al.Quality control of multidrug resistance assay in adult acute leukemia:correlation between assay for P-glycoprotein expression and activity.Blood,1996,87:4809-4827.
4 Yang J,Mani SA,Donaher JL,et al.Twist,a master regulator of morphogenesis,plays an essential role in tumor metastasis.Cell,2004,117:927-939.
5 Aoki Y,Cioca D,Oidaira H,et al.RNA interference may be more potent than antisense RNA in human cancer cell lines.Clin Exp Pharmacol Physiol,2003,30（1~2）:96-102.
6 Budworth J,Gant TW,Gescher A.Co-ordinate loss of protein kinase C and multidrug resistance gene expression in revertant MCF-7/Adr breast carcinoma cells.Br J Cancer,1997,75（9）:1330- 1335.
作者单位： 1 518105 广东深圳，深圳市宝安区松岗人民医院
2 510102 广东广州，中山大学附属第二医院
（编辑：于 伽）