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【摘要】 目的 研究饮食因素对大鼠脂肪细胞葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4,GLUT4）的影响。方法 实验大鼠随机分为正常组（n=10例）、模型组（n=10例）和饮食干预组（n=10例）。模型组和饮食干预组以高糖高脂饲料喂养4周，然后饮食干预组改喂基础饲料6周。Western blot法检测各组大鼠脂肪细胞内、外膜GLUT4含量，并定期测定各组大鼠体质量、血甘油三酯和胆固醇、空腹血糖及血浆胰岛素水平，同时计算胰岛素敏感指数。结果 模型组大鼠脂肪细胞内、外膜GLUT4含量均低于正常组大鼠，差异有显著性（P＜0.05）。与模型组大鼠相比，饮食干预组大鼠脂肪细胞内膜GLUT4含量差异无明显性，但细胞外膜GLUT4含量增加，差异有显著性（P＜0.05）。结论 高糖高脂饮食可能通过降低脂肪细胞GLUT4含量及其转位使大鼠产生胰岛素抵抗。饮食干预治疗可提高脂肪细胞GLUT4含量并改善其转位，增加葡萄糖的提取，提高胰岛素敏感性。
【关键词】 饮食；糖尿病，2型；葡萄糖转运蛋白4；胰岛素抵抗；脂肪细胞
随着生活方式的改变，2型糖尿病的发病率逐年增加。Maianu等［1］发现，2型糖尿病患者的脂肪细胞表现出富含葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）囊泡的亚细胞分布及转位异常。胰岛素抵抗是2型糖尿病的始动因素和关键因素之一。本研究以高糖高脂饮食诱导大鼠产生胰岛素抵抗，并进行饮食干预治疗，观察胰岛素抵抗状态下以及干预治疗后大鼠脂肪细胞GLUT4含量及其转位机制的变化，探讨GLUT4与胰岛素抵抗之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物及其分组 SPF级雄性6周龄Wistar大鼠30只［合格证号：SCXK（鄂）2003-0005，湖北省实验动物中心提供］，体重165~180g。随机分为正常组（C组）、模型组（M组）和饮食干预组（D组），每组10只。实验大鼠每笼3~4只，饲养于标准环境，自由进饮食和水，12h光照周期（06∶00~18∶00照明）。
1.2 胰岛素抵抗大鼠模型的制备 实验大鼠以基础饲料适应性喂养1周后，模型组和饮食干预组大鼠改喂高糖高脂饲料4周，正常组继续以基础饲料喂养。高糖高脂饲料由基础饲料添加20%蔗糖、10%熟猪油、2.5%胆固醇和1%胆酸盐混合而成。
1.3 饮食干预治疗 饮食干预组大鼠以高糖高脂饲料喂养4周后，换以基础饲料继续喂养6周。
1.4 检测指标
1.4.1 体质量（body weight,BW）、血甘油三酯（triglyceride,TG）和胆固醇（cholesterol,TC），空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）及血浆胰岛素（fasting insulin,FINS）水平测定 分别于实验第1周（即高糖高脂饲料喂养前）、第5周（喂养4周）及第11周（饮食干预治疗6周后）检测各组大鼠的体质量。然后禁食12h，腹腔注射1%戊巴比妥（40mg/kg体重）麻醉，进行心脏采血。以美国Beckman CXT型全自动生化分析仪测定TG、TC；优越血糖仪AdvantageⅡ（美国罗氏诊断公司生产）测FPG；FINS采用CIS放免试剂盒（中国原子能研究所提供）测定，同时计算胰岛素敏感指数ISI=ln［1/（FPG×FINS）］［2］。
1.4.2 脂肪细胞GLUT4含量测定
1.4.2.1 脂肪细胞内、外膜的制备 制备方法参照文献［3］。
1.4.2.2 Western blot法检测GLUT4含量 取等量的膜蛋白溶液加入等体积的2倍SDS凝胶加样缓冲液［100mmol/L Tris Cl（pH6.8）、200mmol/L二硫苏糖醇、4%SDS、0.2溴酚蓝、20%甘油］，煮沸10min，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至硝酸纤维素（NC）膜上。室温下以封闭液封闭NC膜1h，与小鼠抗大鼠GLUT4单克隆抗体（R&D Systems公司生产）4℃孵育过夜，再与辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG室温下孵育1h。洗膜后加入ECL（增强化学发光）试剂反应1min，立即用Kodak底片曝光，洗片后经Bid-1D型凝胶电泳成像系统扫描，应用HPIAS-1000图像分析软件，以正常组细胞内膜的GLUT4含量为100作为标准，确定X线片上GLUT4的相对含量。封闭液、辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG和ECL试剂均来自Protein DetectorTM LumiGLO Western Blot试剂盒（KPL公司生产）。
1.5 统计学方法 使用SPSS11.5统计分析软件对实验数据进行统计学处理，所有数据均用（x±s）表示，多组间数据比较采用方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 各组大鼠BW、血TG和TC、FPG、FINS水平和ISI的变化 以基础饲料适应性喂养1周后（实验第1周），各组大鼠BW、血TG和TC、FPG、FINS和ISI水平均接近，差异无显著性。模型组和饮食干预组大鼠给予高糖高脂饮食4周后（实验第5周），BW、血TG和TC、FINS水平明显高于正常组，而ISI低于正常组，差异均有显著性（P＜0.01），而FPG水平的差异无显著性意义。饮食干预组改喂基础饲料6周后（实验第11周），与模型组相比，BW、血TG和TC、FPG水平均下降（P＜0.01），ISI升高（P＜0.01），FINS水平差异无显著性；而FPG水平接近正常组，其他指标与正常组的差异均有显著性（P＜0.01），见表1。 表1 实验第1周、第5周和第11周各组大鼠BW、TG、TC、FPG、FINS和ISI的水平 （注：C：正常组；M：模型组；D：饮食干预组；BW：体质量；TG：甘油三酯；TC：胆固醇；FPG：空腹血糖；FINS：空腹胰岛素；ISI：胰岛素敏感指数；与C组比较，*P＜0.01；与M组比较，▲P＜0.01
2.2 实验大鼠脂肪细胞GLUT4含量的比较 模型组大鼠脂肪细胞内、外膜GLUT4含量均明显低于正常组，分别为［（61.28±4.75）vs 100］和［（36.00±3.97）vs（57.91±3.20）］，差异均有显著性（P＜0.05）。饮食干预组大鼠脂肪细胞内膜GLUT4含量和模型组的差异［（58.74±5.89）vs（61.28±4.75）］差异无显著性；细胞外膜GLUT4含量则明显高于模型组［（47.92±4.85）vs（36.00±3.97）］，但仍低于正常组［（47.92±4.85）vs（57.91±3.20）］，差异均有显著性（P＜0.05）。
3 讨论
胰岛素抵抗的发生机制十分复杂，可分为受体前、受体和受体后缺陷。机体外周组织细胞膜上葡萄糖的转运障碍是受体后缺陷的重要原因之一。葡萄糖的跨膜转运是由位于细胞膜上的葡萄糖转运蛋白（GLUT）介导并以易化扩散的方式实现的。GLUT4仅存在于对胰岛素敏感的脂肪细胞和肌细胞中。基础状态下，GLUT4主要位于细胞内的囊泡中；胰岛素刺激后，富含GLUT4的囊泡向细胞外膜移动，GLUT4转位至细胞外膜，摄取和利用葡萄糖增加［4］。Dale等［5］通过选择性降低小鼠脂肪组织GLUT4的表达，发现尽管小鼠肌肉GLUT4表达正常，但对胰岛素刺激的葡萄糖摄取能力大大降低（约下降40%），同时肌肉和肝脏的胰岛素刺激性3-羟基磷酸肌醇激酶活性也比正常低50%~60%。以上研究提示脂肪细胞GLUT4表达水平的下降可诱导其他组织的胰岛素抵抗，脂肪组织在介导体内葡萄糖处理中具有独特的作用。
本研究结果显示，模型组大鼠脂肪细胞GLUT4含量明显低于正常组。模型组和饮食干预组大鼠给予高糖高脂饮食4周后出现高胰岛素血症，而空腹血糖水平并不下降，同时体质量、血甘油三酯和胆固醇水平均升高、胰岛素敏感指数降低，提示大鼠已经产生胰岛素抵抗。饮食干预组大鼠脂肪细胞内膜GLUT4含量接近于模型组、细胞外膜GLUT4含量却明显高于模型组，但都低于正常组。饮食干预6周后大鼠脂肪细胞GLUT4的转位机制有所改善，同时空腹血糖水平下降、胰岛素敏感指数升高，其他指标也有不同程度的改善。有研究发现［6］，高脂饮食可下调白色脂肪组织中的GLUT4水平，并明显减弱由胰岛素刺激的脂肪细胞GLUT4的转位及葡萄糖的摄取。这可能是高糖高脂饮食诱导胰岛素抵抗产生的机制之一。饮食干预治疗改变了GLUT4的亚细胞分布，改善了脂肪细胞GLUT4的转位，使脂肪组织摄取和利用葡萄糖的能力增加，这是其改善机体外周组织对胰岛素的敏感性、减轻胰岛素抵抗的可能机制之一。由此可见，饮食干预治疗是预防和治疗糖尿病的重要方法之一，对于存在胰岛素抵抗状态如肥胖、糖耐量减低或2型糖尿病、血脂异常等患者尤为重要。
【参考文献】
1 Mianu L, Keller SR, Garvey WT. Adipocytes exhibit abnormal subcellular distribution of vesicles containing GLUT4 and insulin-regulated aminopeptidase in type 2 diabetes mellitus: implications regarding defects in vesicle trafficking. Clin Endocrinol Metab,2001,86（11）:5450.
2 李光伟，潘孝仁.Lillioja S,等.检测人群胰岛素敏感性的一项新指数.中华内科杂志，1993，32（10）：656.
3 Paula CP, Alessandra MV, Jos S, et al. GLUT4 protein is differently modulated during development of obesity in monosodium glutamate-treated mice. Life Sciences,2002,71（16）: 1917.
4 Watson RT, Pessin J. Intracellular organization of insulin signaling and GLUT4 translocation. Recent Prog Horm Res,2001,56（3）:175.
5 Dale A, Odile P, Jason K, et al. Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver. Nature,2001,409（6821）:729.
6 Takahashi Y, Ide T. Dietary n-3 fatty acids affect mRNA level of brown adipose tissue uncoupling protein 1, and white adipose tissue leptin and glucose transporter 4 in the rat. Br J Nutr,2000,84（2）:175.
作者单位： 435200 湖北阳新，阳新县中医院内分泌科
（编辑：陆 淼）