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【摘要】 目的 观察缺氧时GDNF和HSV-GDNF对体外培养的大鼠脊髓运动神经元Bcl-2表达的影响。方法 尼氏染色，观察缺氧2~4h和缺氧4h后恢复供氧24、72h脊髓运动神经元存活数。抗Bcl-2血清行免疫组化染色，计数Bcl-2免疫反应（Bcl-2-IR）阳性神经元数目，同时对Bcl-2-IR阳性神经元作平均光密度的色谱分析。结果 GDNF组、HSV-GDNF组脊髓运动神经元缺氧后在神经元存活数、Bcl-2-IR阳性神经元数目和平均光密度三项指标上均明显高于对照组（P＜0.05），但HSV-GDNF组的结果更好。结论 HSV-GDNF比GDNF更能增强缺氧时脊髓运动神经元Bcl-2的表达，抑制缺氧后神经元的死亡。
【关键词】 胶质细胞源性神经营养因子；单纯疱疹病毒；载体；Bcl-2；细胞，培养的；细胞凋亡
Effects of GDNF and HSV-GDNF on Bcl-2 expression of spinal cord motoneurons of rats after anoxia in vitro
WANG Chang-li,ZHOU Chang-man,SU Jian-bin.Department of Pathology,323rd Hospital of PLA,Xi'an 710054,China
【Abstract】 Objective To study the effects of GDNF and HSV-GDNF on Bcl-2 expression of spinal cord motoneurons of rats after anoxia in vitro.Methods Spinal cord motoneurons were Nissl stained and counted the number of survival neurons after anoxia 2,4 hours and reoxygenation for 24 and 72 hours.At the same time,neurons were immunohistochemical stained by the antiserum of Bcl-2.The number and the mean optical densities of Bcl-2 immunoreactive positive neurons were respectively observed.Results By drawing a comparison with corresponding samples,it showed that these three items in GDNF and HSV-GDNF group were significantly improved after anoxia.The effects of HSV-GDNF were better than those of GDNF after anoxia.Conclusion HSV-GDNF may protect motoneurons from the damage induced by anoxia in better degree than GDNF and improve Bcl-2 expression of spinal cord motoneurons.
【Key words】 glial cell line-derived neurotrophic factor;herpes simplex virus;vector ;Bcl-2;cells,cultured;apoptosis
胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）是目前发现的在体外支持运动神经元生长的最有效的神经营养因子之一［1］，对脊髓运动神经元等多种神经元具有促进生长、延缓衰老、减少死亡等功能。但是GDNF难以透过血脑、脊髓等屏障。因此人们一直在努力找寻一种合适的载体，将GDNF基因导入神经元。单纯疱疹病毒（HSV）-Ⅰ型因其嗜神经细胞、构建简单、高效率以及感染后可在神经元内建立隐性感染状态等特点日益受到关注。MJ.During［2］等对复制缺陷的HSV-Ⅰ型载体较成功的应用，说明了HSV作为神经系统基因转移载体的可行性。Bcl-2为癌基因bcl-2的蛋白产物，是一种新型调节蛋白［3］。除淋巴系统外，bcl-2基因在神经系统也有表达［4］，神经元对Bcl-2的过度表达能够抑制或阻断神经元的凋亡［5］。本实验用Nissl染色和免疫组化方法，旨在观察GDNF和HSV-GDNF对体外培养大鼠脊髓运动神经元缺氧时Bcl-2表达的影响。
1 材料与方法
1.1 HSV扩增子病毒 质粒型单纯疱疹病毒混合毒株dvHSV-GDNF由中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室吴小兵博士提供。dvHSV-GDNF携带有大鼠全长的GDNF cDNA。
1.2 脊髓运动神经元的培养 按已有方法［6］操作并部分改良。无菌条件下取出E16 Wistar大鼠子宫，分离胎鼠脊髓，将腹侧半用1.25g/L胰蛋白酶消化（37℃，30min）、吹打、静置（使胶质细胞下沉），吸上清，最终稀释成5×105/ml密度接种于六孔板（孔内置涂过多聚赖氨酸的盖玻片），置37℃含5% CO2的培养箱内。培养液为含15%胎牛血清的DMEM。第2天时加入阿糖胞苷（抑制胶质细胞过度增殖），作用48h后更换培养液，以后隔天更换半液。
1.3 缺氧实验［7］ 血清培养7天后，随机分成对照组、GDNF组和HSV-GDNF组。GDNF组和HSV-GDNF组缺氧前24h分别向培养液中加入150μl 0.1μg/ml的GDNF和150μl滴度为6.7×108感染颗粒/ml的HSV-GDNF悬浮液，给予对照组等量磷酸盐缓解液PBS。24h后用石蜡油封闭各孔，缺氧条件下继续培养2~4h和4h后重新置于培养箱内培养24h和72h。
1.4 形态学观察 观察神经元的生长情况，并于缺氧前和缺氧2~4h以及4h后恢复供氧24、72h时在倒置相差显微镜（200×）下随机观察并计数50个视野（0.16mm2/视野）的存活脊髓运动神经元数。
1.5 Nissl染色观察 将缺氧2~4h和4h后重新恢复供氧24、72h的神经元标本取出，0.01mol/L PBS清洗3次（每次5min），4%多聚甲醛固定1.5h后，用0.01mol/L PBS清洗3次（每次5min），再用0.25%硫堇浸染10min后,分别用95%Ⅰ、95%Ⅱ酒精脱水和二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分色。
1.6 Bcl-2免疫组化观察 各组神经元4%多聚甲醛固定后，用Bcl-2抗血清（1∶200稀释），依ABC法行免疫组化染色，DAB显色。同时设替代对照（正常羊血清替代第一抗体）。显微镜（200×）下随机计数50个相邻视野（0.16mm2/视野）中Bcl-2-IR阳性神经元数目，并在MIAS真彩病理图像分析仪上对Bcl-2-IR阳性神经元作平均光密度的色谱分析。
2 结果
2.1 形态学观察和Bcl-2在培养的脊髓运动神经元中的表达 E16大鼠脊髓运动神经元种植后1天，大部分神经元贴附盖玻片生长，胞体呈圆形、饱满、透亮，很多已有突起；4天时，神经元胞体增大，立体感强，有明显折光性。培养7天时神经元胞体变得肥厚，突起增长变粗、互相联络成网。缺氧前对照组、GDNF和HSV-GDNF三组的脊髓运动神经元的存活数以及Bcl-2-IR阳性神经元数目和平均光密度均无明显差异（见表1~3）。Bcl-2免疫组化染色显示，Bcl-2蛋白分布于运动神经元胞体内，染色为浅紫色（见图1~3）；正常羊血清对照为阴性。
2.2 培养神经元的Nissl染色 缺氧2~4h三组均有运动神经元呈现：胞浆内有深紫色的呈块状或点状尼氏体，核空泡状，核仁着色明显，核质不着色。对照组此种细胞最多，其次是GDNF组；恢复供氧24~72h各组核空泡状神经元数量均有所下降，HSV-GDNF组此种细胞最少，GDNF组次之。
2.3 缺氧对大鼠脊髓运动神经元形态、存活数和Bcl-2表达的影响 缺氧2~4h，各组脊髓运动神经元存活数较缺氧前明显减少，部分神经元胞体增大，出现肿胀，少数神经元胞体内出现空泡。HSV-GDNF组神经元存活数高于GDNF组，且两组均高于同期对照组（P＜0.05）；缺氧4h后恢复供氧24~72h，各组存活神经元的肿胀消失，但神经元存活数进一步减少（表1）。Bcl-2染色结果显示，缺氧2~4h各组的Bcl-2-IR阳性神经元数目均减少（表2），但GDNF组和HSV-GDNF组Bcl-2-IR较缺氧前明显增强，神经元由浅紫色逐渐变成深紫色，对照组变化不明显（见图4~6）；重新恢复供氧24~72h GDNF和HSV-GDNF组神经元的Bcl-2-IR阳性神经元染色逐渐减弱，由深紫色逐渐变成浅紫色（见图7~9）。图像分析表明，缺氧2h时各组Bcl-2-IR阳性神经元的平均光密度较缺氧前明显增强，HSV-GDNF组Bcl-2-IR阳性神经元的平均光密度明显高于其余两组，P＜0.05（表3）。
2.4 GDNF和HSV-GDNF对缺氧时脊髓运动神经元存活数和Bcl-2表达的影响 经GDNF和HSV-GDNF孵育的神经元缺氧后Bcl-2-IR较对照组增强；神经元存活数和Bcl-2-IR阳性神经元数目也明显高于对照组，且HSV-GDNF组的结果优于GDNF组。图像分析结果同样显示，缺氧2~4h及重新恢复供氧后24和72h，HSV-GDNF组的Bcl-2-IR阳性运动神经元的平均光密度最高，GDNF组次之。 表1 GDNF和HSV-GDNF对缺氧时脊髓运动神经元存活数的影响 注：与缺氧前、对照组比较，*P＜0.05；与缺氧前、对照组及GDNF组比较，#P＜0.05 表2 缺氧对Bcl-2-IR阳性脊髓运动神经元数目的影响 注：与缺氧前、对照组比较，*P＜0.05；与缺氧前、对照组及GDNF组比较，#P＜0.05表3 缺氧对Bcl-2-IR阳性脊髓运动神经元平均光密度的影响 注：与缺氧前、对照组比较，*P＜0.05；与缺氧前、对照组及GDNF组比较，#P＜0.05对照组 GDNF组 HSV-GDNF组
图1、2、3 缺氧前对照组、GDNF组和HSV-GDNF组的Bcl-2免疫组化染色（200×）;图4、5、6 缺氧2h时对照组、GDNF组和HSV-GDNF组的Bcl-2免疫组化染色（200×）;图7、8、9 缺氧4h后重新恢复供氧72h时对照组、GDNF组和HSV-GDNF组Bcl-2免疫组化染色（200×） （标尺=20μm）
3 讨论
目前已知有多种基因参与细胞凋亡的调控，其中bcl-2基因能抑制细胞凋亡。Bcl-2过量表达能延长神经元生存，亦可抑制包括坏死在内的非凋亡细胞死亡［8］。由于神经元仅能生长不能分裂，这就决定了保护神经元，挽救受损神经元有着重要意义。Garcia［9］等将表达bcl-2基因的质粒显微注入依赖生长因子的体外培养的感受神经元，可预防去除神经生长因子诱发的神经元凋亡。Farlie［10］等发现Bcl-2能明显延缓切断坐骨神经引起的运动神经元凋亡。这提示我们，提高Bcl-2表达或许可以抑制和减少运动神经元的凋亡。GDNF对神经细胞凋亡有很好的抑制作用，它不但能够挽救E6~9d凋亡期的1/4运动神经元不死亡，而且几乎可使新生鼠切断坐骨神经后的运动神经元全部存活［11］。但GDNF是否通过提高Bcl-2表达抑制了神经元凋亡目前尚不可知。复制缺陷的HSV-Ⅰ假型病毒混合毒株dvHSV-GDNF的成功构建为我们提供了很好思路。本实验观察了GDNF和HSV-GDNF对缺氧时运动神经元Bcl-2表达的影响。实验观察到，分散培养的脊髓运动神经元在缺氧前各组神经元存活数以及Bcl-2-IR阳性神经元数目和Bcl-2-IR阳性神经元平均光密度均无明显变化。但缺氧2h，各组出现大量核空泡状神经元，且Bcl-2-IR阳性神经元平均光密度较缺氧前明显增强，而后又逐渐减弱。推测缺氧早期脊髓运动神经元Bcl-2表达增强可能是缺氧的应激反应。重新恢复供氧后神经元的Bcl-2表达减弱可能与缺氧后神经元的大量死亡有关。实验还观察到，GDNF和HSV-GDNF组的运动神经元缺氧后神经元存活数和Bcl-2-IR阳性神经元数目均明显高于对照组，且HSV-GDNF的功效更好。图像分析显示，GDNF组和HSV-GDNF组缺氧后2~4h及重新恢复供氧后24~72h，HSV-GDNF与GDNF组的Bcl-2-IR神经元数目均明显高于对照组，组间差异显著（P＜0.05），表明HSV-GDNF比GDNF更能够增强缺氧后脊髓运动神经元Bcl-2的表达，减少神经元的死亡。我们以往的实验［12］已经证明，HSV-GDNF能够高效率转染体外培养的大鼠脊髓神经元并表达有活性的GDNF。但是GDNF通过何种机制抑制神经元凋亡，以及HSV-GDNF抑制凋亡的机制与GDNF是否相同，都有待于进一步研究。
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10 Dubois-Dauphin M,Frankowski H,Tsujimoto Y,et al.Neonatal motoneurons overexpressing the bcl-2 protooncogene in transgenic mice are protected from axotomy-induced cell death.Proc Nat1 Acad Sci USA,1994,91（8）:3309-3313.
11 Xu Shao-fen.Neurobiology.Shanghai:medical university press,1999,108-110.
12 苏剑斌，鄂玲玲，徐忠涛，等.质粒型（HSV）载体介导的GDNF和GFP基因在BHK细胞和骨骼肌细胞中的转移和表达.神经解剖学杂志，2000，16（2）：127-130.
*基金项目:全军医学科研基金面上项目（98M117）
作者单位： 1 710054 陕西西安,解放军第323医院病理科
2 100071 北京,解放军北京军医学院解剖教研室
（编辑：田 雨）