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【摘要】 目的 在一个较大样本的基础上从孕妇和胎儿两个角度来综合评价经皮附睾穿刺取精术（PESA）结合卵细胞浆内单精子注射技术（ICSI）治疗无精子症的安全性和有效性。方法 将同期因少弱精子症而行ICSI的患者274例共317个促排卵周期设为对照组，试验组为行PESA+ICSI治疗的121例无精子症患者，共行促排卵周期140个。比较两组的妊娠和胎儿出生情况并定期随访出生后后代的发育情况。结果 妊娠率试验组显著高于对照组（51.43% vs 39.43%，P<0.05），流产率及妊高征发生率两者无明显统计学差异（12.5% vs 11.2%；6.94% vs 9.60%，P>0.05）。胎儿出生体重、性别比及总的畸形发生率两组间差异亦无显著性（P>0.05）。结论 PESA结合ICSI方法并没有增加妊娠分娩并发症及胎儿畸形的发生率，因此是治疗男性无精子症的一种安全、有效的方法。
【关键词】 经皮附睾穿刺取精术；无精子症；卵细胞浆内单精子注射术；并发症
Retrospective study about offspring’s safety of ICSI with sperm obtained by PESA for the treatment of azoospermia
JIN Lei，ZHU Gui-jin，ZHANG Han-wang，et al.
Reproductive Medicine Center，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China
【Abstract】 Objective To judge synthesizedly about the safety and effectiveness of intracytoplasmic sperm injection（ICSI） with sperm obtained by percutaneous epididymal sperm aspiration（PESA）.Methods The control group was defined as ICSI aiming to treat oligoasthenozoospermia，which included 274 patients totally carrying out 317 hyper-stimulating cycles.The experimental group was 121 patients suffered from azoopermia，which accepted PESA+ICSI treatment in 140 cycles.To compare pregnancy and birth situations between experimental group and control group，then follow-up offspring’s development regularly were performed.Results The experimental group’s pregnant rates were prominently statistically higher than those of the control group （51.43% vs 39.43%，P<0.05），miscarriage rates and incidence of pregnancy-induced hypertension syndrome （PIH） were of no differences between the two groups （12.5% vs 11.2%;6.94% vs 9.60%，all P>0.05）.No differences were found in newborn’s weight、sexual ratio and total incidence of malformation （P>0.05）.Conclusion ICSI using PESA sperm doesn’t increase the incidence of pregnanct complications and offspring’s malformation，so it is a safe and effective method to treat azoospermia.
【Key words】 percutaneous epididymal sperm aspiration；azoospermia；intracytoplasmic sperm injection;complications
卵细胞浆内单精子注射技术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）与睾丸或附睾显微取精技术在临床上的联合应用解决了男性无精子症患者生育遗传学后代的难题，临床上也已取得巨大成功。接受ICSI者睾丸或附睾精子多为不成熟精子，活动力也较差，其质量较正常射出的精子是有所下降的，尽管有不少研究者证实了该技术的有效性［1，2］（大多仅从受精率、卵裂率、种植率及临床妊娠率等角度出发），但孕妇的妊娠结局及后代安全性的报道尚处于空白。故本文欲通过对本中心121例无精子症患者经皮附睾穿刺抽吸术（PESA）+ICSI治疗后孕妇妊娠分娩及胎儿发育情况的回顾性分析，从而在一个较大样本的基础上来探讨PESA结合ICSI方法治疗无精子症的安全性和有效性。
1 对象与方法
1.1 研究对象
自1999年10月第1例PESA+ICSI病例开始，至2004年8月，共121对夫妇在我中心接受PESA+ICSI治疗，共进行140个促排卵周期。收集同时期在本中心因少弱精子症而接受ICSI治疗的患者274例共317个促排卵周期。无精子症的诊断标准为3次射精精液离心后均未发现精子。少精子症和（或）弱精子症的诊断参见 WHO的诊断标准［3］。所有患者染色体检查均正常，性激素测定在正常范围之内。
1.2 ICSI前精子的获取
1.2.1 经皮附睾穿刺抽吸术（percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA）
针对无精子症患者，本中心首选PESA方法获取精子。术前准备齐备后，将附睾固定于阴囊皮下，用1ml TB注射器于肉眼直视下穿刺附睾头并负压抽吸，直至针管内有淡黄色浑浊附睾液体抽出。如未见液体抽出，则改变穿刺点或行对侧附睾穿刺，直至所穿出的附睾液经镜检发现活动精子。如PESA最终未穿到活精子，则改用睾丸精子抽取术（testicular sperm extraction，TESE）取精，若后者仍未找到活精，则只能考虑接受供精。
与此同时，为了尽可能减轻患者反复穿刺取精的痛苦，中心还将诊断性穿刺或ICSI后剩余的微量精子加以冷冻，以备用于以后的促排卵周期，临床上也已取得了一定的成果［4］，是一项值得推广的技术。
1.2.2 射精
至少禁欲2天，少弱精子症患者在采卵当日手淫法取精。
1.3 ICSI前精子的准备
1.3.1 PESA精子的处理
附睾穿刺取出较多活精子后，加入Spermrinse（美国Vitrolife产品）洗涤精子两次（1000r/min，5min），并将沉淀密度调为2~5个活精子/HP，后置于培养皿内待行ICSI。若取出的活精子数目极少，则不进行处理，而是直接从培养皿内挑取活精子行ICSI。
若先前有PESA冻精，则采卵当日复苏冻精，过程参见文献［5］。若发现足够活精子，则采用PESA冻精行ICSI；若未找到足够活精子，则重新穿刺取精。
1.3.2 射精精液的处理
采用上游法处理精液，吸取其上清并置于培养皿内待行ICSI。极度少精者（如每高倍镜下仅可见数个活精子）不进行上游处理，其处理方法同上述PESA精子的处理。
1.4 超促排卵及卵子获取
按本中心常规方案进行超促排卵，适时监测、取卵及卵细胞处理，最后将MⅡ期成熟卵子置入培养皿内待行ICSI。
1.5 ICSI、受精、卵裂、种植及妊娠情况的观察
试验组及对照组分别对1915、3364个MⅡ期成熟卵子行ICSI［6］，分别移植胚胎616、1099个（剩余优质胚胎冷冻保存）。胚胎移植后通过血β-HCG（β-human chorionic gonadotropin，人绒毛膜促性腺激素）及B超检测以确定临床妊娠。如宫内胚胎数目≥3个，则行选择性减胎术。妊娠3个月后嘱患者当地医院定期产检，定期随访记录妊娠、分娩、胎儿出生情况及其后的体质及智商发育等情况。
1.6 统计学方法
采用SPSS 11.5统计分析软件包进行统计学处理，样本均数的差异性分析采用t检验，率的差异性分析采用χ2检验。计数资料采用方差分析，结果采用均数±标准差（±s）来表示。
2 结果
2.1 试验组与对照组一般情况的比较
见表1。表1 试验组与对照组一般情况比较（略）注：*两组在男方年龄、女方年龄及不孕年限等方面均差异无显著性（Ｐ>0.05）
2.2 两组间孕妇妊娠情况的比较
试验组共妊娠72例，其中单胎妊娠49例，双胎妊娠17例，三胎及三胎以上妊娠6例，流产9例，宫外孕1例。对照组共妊娠125例，其中单胎妊娠82例，双胎妊娠35例，三胎及三胎以上妊娠8例，流产14例。
2.3 两组间胎儿出生情况的比较
试验组中剖宫产55例，顺产7例，共出生活胎81例，死胎1例。对照组中剖宫产99例，顺产12例，共出生活胎145例，死胎2例，2例伴新生儿黄疸，活胎中有3例在出生后20天内死亡（3例均为早产儿）。胎儿平均出生体重及性别比见表2。表2 试验组与对照组两组间ICSI后情况比较（略）注：＃妊娠率试验组显著高于对照组（P<0.05）；*两组间的流产率、妊高征发生率、新生儿出生体重、性别比以及总的畸形率差异均无显著性（P>0.05）
2.4 出生后的随访情况
对胎儿出生后的情况进行电话跟踪随访，发现了以下异常：试验组中1例伴尿道下裂，1例为脐疝，1例斜颈。对照组中1例为缺氧缺血性脑病，1例肾积水、左肾缺如，1例右尿道狭窄、右肾积水，1例为先心病，1例脐疝、阴囊疝，1例为两性畸形。总的畸形率两组间差异无显著性（见表2）。另外，本中心还对1岁以上儿童的体质以及智商发育情况进行了电话随访，亦未发现明显的异常，其体质及智商发育均与同龄儿无太大差异，仅对照组中出现1例两次全麻手术后智商略低于其同胞妹妹（一次疝手术，一次手指矫正手术）。
研究期间内，PESA冻精ICSI后共获得了8例妊娠且均成功分娩，无明显并发症发生，所分娩的10例胎儿中也未出现明显畸形。
3 讨论
3.1 PESA精子的ICSI技术
ICSI技术实现了极少量精子使卵子受精的目的，近年来ICSI又与显微外科取精技术如显微外科附睾精子抽吸术（microsurgical epididymal sperm aspiration，MESA）、PESA及TESE等结合来治疗无精子症［7，8］，使得自然情况下根本无法生育的无精子症患者看到了生育后代的希望，同时也进一步拓展了辅助生殖技术的治疗范围。
3.2 PESA精子的安全性
目前虽然PESA结合ICSI技术在临床上得到了广泛的应用，但仍有一些学者对它的安全性提出质疑。ICSI结合显微取精技术未进行动物试验便直接应用到了临床，缺乏可靠的试验依据。M.O′Connell等［9］研究发现PESA精子的线粒体DNA突变率高，核DNA完整性差，这些均提示应谨慎地对待PESA精子的ICSI。国内外的许多报道均证实了PESA结合ICSI技术治疗无精子症的有效性［1，2，10］。但以上文献均未涉及后代安全性的研究。众所周知，针对PESA+ICSI技术，人类在关注其受精及妊娠情况的同时，更关注的是后代的出生以及其后的发育甚至生育情况。由于最早出生的1例PESA+ICSI后代目前还未进入青春期，所以探讨该技术的安全性只能从其出生情况及出生后的体质、发育以及智商等角度来进行评判，本中心采取了电话随访的方式，虽然带有一定的主观性，但从临床角度考虑，该方法却有着较大的实用性。同时我们也期待着将来对后代的生育能力做进一步的观察研究。
与其他文献结果［1，2，10］不同的是，本组观察对象妊娠率试验组显著高于对照组，这似乎与PESA精子质量较差的结果相悖，分析其原因，这可能与人们对显微外科取精术的接受程度有关。在PESA结合ICSI技术开展的早期，由于传统观念的影响，不少人无法接受这一带有微创性的手术，因而接受PESA+ICSI治疗的患者大多分布在ICSI技术已较为成熟的后期。然而，对照组接受ICSI治疗的患者并不存在这样的规律，因此使得本研究中试验组的总体妊娠率反而高于对照组。
在本研究中，流产率、妊高征发生率、胎儿出生以及出生后的随访结果两组均未发现明显的不同，这些均提示，PESA精子并没有对胚胎的变化、发育等远期结局造成明显的负面影响，因而从某种程度上说，PESA结合ICSI技术是治疗男性无精子症的一种安全、有效的方法。
3.3 PESA冻精的安全性
本研究还观察了PESA冻精的ICSI结局，并没有发现明显的妊娠并发症及胎儿畸形。另有研究比较了PESA冻精与新鲜PESA精子ICSI后的妊娠结局及胎儿出生情况，亦未发现明显差异［5］。以上均提示，采用PESA冻精ICSI是一项安全、有效而实用的技术，具有较大的临床应用价值［11，12］。
综上所述，采用PESA新鲜精子甚至冻精进行ICSI并没有增加妊娠分娩并发症及胎儿畸形的发生率，因此是治疗男性无精子症的一种安全、有效的方法。
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作者单位： 430030 湖北武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心