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［摘要］ 目的 建立一种简便、快速的高效液相色谱（HPLC）荧光检测法测定人体内血浆中氟伐他汀的浓度。方法 采用Kromasil C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温40 ℃，流动相为13 mmol/L溴化四丁基铵-乙腈（51∶49），流速为1.0 ml/min，荧光检测激发波长305 nm，发射波长405 nm。结果 氟伐他汀在1~1000 μg/L范围内线性关系良好（r=0.9994）。日内和日间RSD均低于10%。结论 该方法灵敏度高、快速、简便、无杂质干扰，适合于氟伐他汀的体内分析和人体药动学研究。
［关键词］ 氟伐他汀；血浆；色谱法；高压液相；荧光检测
Determination of fluvastatin sodium concentration in human plasma by high performance liquid chromatography with fluorescence detection
YI Ping,LIU Shi-kun,XU Hai-ping,et al.Pharmaceutical Preparation Section,Hunan Provincial Cancer Hospital,Changsha 410013,China
［Abstract］ Objective To establish a simple and rapid method for determination of fluvastatin in human plasma by HPLC.with fluorescence detection.Methods Chromatographic column was KromasilC18（4.6 mm×150 mm,5 μm）and 40 ℃ of column temperature.The mobile phase consisted of 13 mmol/L Tetrabutylammonium chloride-acetonitrile（51∶49）with a flow rate of 1.0 ml/min.A fluorescence detector was set at λcx305,λcm405nm.Results The lower limit of qualification was 1 μg/L.The calibration curve was in good linearity over the range of 1~1000 μg/L（r=0.9994）.The intar-day and inter-day RSD were less than 10%.Conclusion The method is sensitive,rapid and suitable for the study of pharmacokinetics of fluvastatin.
［Key words］ fluvastatin sodium;plasma;chromatography;high pressure liquid;fluorescence detection
氟伐他汀（fluvastatin）是胆固醇合成早期阶段限速酶HMG-CoA还原酶的抑制剂。它能降低血浆中总胆固醇、低密度脂蛋白和载体蛋白B的水平，中等程度降低甘油三酯的水平，同时还能提高高密度脂蛋白-胆固醇水平。它主用于饮食不能完全控制的高胆固醇血症。国外已有氟伐他汀血药浓度测定的报道［1~3］，但尚未见国内的有关报道。为此，笔者结合国外文献建立了高效液相荧光检测法测定人体内血浆中氟伐他汀的浓度，用于研究氟伐他汀的药动学。
1 材料与方法
1.1 主要仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪；CBM-20Alite系统控制器；LC-20AT输液泵；CT0-20A柱温箱；SIL-20A自动进样器；10A-RF荧光检测器；LC solution工作站。
1.2 药品与试剂 氟伐他汀钠对照品（北京诺华制药有限公司，纯度99.7%）；氟伐他汀钠胶囊（商品名：来适可，北京诺华制药有限公司，规格40 mg/粒，批号05019）；乙腈（色谱纯，Tedia公司）；叔丁基甲醚（色谱纯，美国Fisher公司）、溴化四丁基铵等为分析纯；水为二次蒸馏水。
1.3 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×150 mm,5 μm）；柱温：40 ℃，流动相：13 mmol/L溴化四丁基铵-乙腈（51∶49）；流速：1.0 ml/min；荧光检测激发波长305 nm，发射波长405 nm；进样量：40 μl。
1.4 样品的处理 取待测血浆0.5 ml于10 ml离心管中，加入0.5 ml磷酸盐缓冲液（pH=3.0）混匀，再加入叔丁基甲醚4 ml，涡漩3 min，静置5 min后4000×g离心5 min，定量吸取3 ml有机相转至另一管中，室温N2吹干，残渣用100 μl流动相溶解，取上清进样40 μl。
2 结果
2.1 色谱图 见图1。A、B、C分别为空白血浆、空白血浆+氟伐他汀标准品、受试者服药后血浆供试品的荧光色谱图。氟伐他汀的保留时间为8.0 min，血浆内源性物质及其他杂质不干扰样品的分离测定。
2.2 标准曲线制备 用空白血浆将氟伐他汀标准溶液（100 mg/L）配制成不同浓度（1，2.5，5，10，25，50，100，250，500，1000 μg/L）的标准液，按上述样品处理方法操作后测定。以氟伐他汀峰面积（y）与浓度（x）进行线性回归，得回归方程为y=105591x-8984,（r=0.9994,n=10），线性范围为1~1000μg/L，最低定量限为1 μg/L。
图1 氟伐他汀色谱图
A:空白血浆；B：空白血浆+氟伐他汀；
C：血浆供试品；F：氟伐他汀
2.3 回收率及精密度 按“标准曲线制备”项下制备低、中、高三个浓度（分别为2.5、25、500 μg/L），各浓度日内重复测定5次，并连续测定3天，每日5份。计算其方法回收率及日内、日间精密度。测得日内平均实测浓度分别为（2.40±0.17）μg/L、（24.1±1.1）μg/L、（49.6±2.1）μg/L；日内RSD分别为7.10%、4.51%、4.17%；方法回收率分别为95.83%、96.42%、99.26%。日间平均实测浓度分别为（2.35±0.19）μg/L、（24.0±1.2）μg/L、（48.3±2.3）μg/L；日间RSD分别为：8.03%、5.04%、4.80%。
2.4 样品萃取回收率 空白血浆中加入氟伐他汀标准溶液（100 mg/L）配制低、中、高三个浓度（2.5、25、500 μg/L）的标准血样。按上述样品处理方法操作后测定。另用水配制相应低、中、高三个浓度的氟伐他汀溶液，不经任何处理取40 μl直接进样，以此为标准，将两组峰面积进行比较计算氟伐他汀的萃取回收率。低、中、高三个浓度系列氟伐他汀的萃取回收率分别为（62±7）%、（65±5）%、（67±4）%。
2.5 人体内药动学研究 应用本文建立的方法对12名健康受试者进行氟伐他汀钠胶囊的药动学研究。12名健康受试者，经常规检查证明肝、肾功能正常，禁食过夜后，单次口服氟伐他汀钠胶囊40 mg。服药前（0）以及服药后0.16，0.32，0.5，0.75，1，1.5,2,3,3,4,6,8,10,12 h抽肘静脉血4 ml，分离血浆于-20 ℃保存至测定。12名受试者的药动学参数分别为：t1/2=（2.4±1.0）h,tmax=（0.52±0.21）h,cmax=（468±75）μg/L,AUC0-12=（544±82）μg·h/L，AUC0-∞=（595±93）μg·h/L；平均血药浓度-时间曲线见图2。
图2 12名健康受试者口服40 mg氟伐他汀钠胶囊的平均血药浓度-时间曲线图
3 讨论
国外已有氟伐他汀血浆浓度测定的报道［1~3］，笔者在此基础上优化了测定条件，建立了一种迅速、灵敏、准确的高效液相色谱荧光检测法测定人体内血浆中氟伐他汀的浓度。
在血浆样品预处理方面，采用血浆酸化后再萃取的方法。分别考察了pH=3,4,5,6,7的磷酸盐缓冲液，发现pH=3时，萃取回收率最高，这与文献［3］中提到的pH=6时萃取回收率最高不一致。同时还考察了叔丁基甲醚、乙醚，二氯甲烷等常用萃取剂的萃取效果，二氯甲烷萃取回收率较低，等体积乙醚萃取两次的回收率与叔丁基甲醚萃取一次时相当。考虑到乙醚难以定量转移，最终选定叔丁基甲醚作为萃取剂。国外文献中多选用氟伐他汀的甲基化产物作为测定内标，考虑到内标的难以获得，故采用外标法，在实验中严格控制各处理步骤使得本实验建立的测定方法符合生物样品测定要求。
流动相选择方面考察了乙腈和甲醇对氟伐他汀测定的影响，发现在乙腈中氟伐他汀的吸收是在甲醇中的2倍左右。单纯使用磷酸盐缓冲液和乙腈作为流动相时，血浆杂质干扰很大；加用离子对试剂溴化四丁基铵后，发现血浆杂质干扰大大减小，适于低浓度氟伐他汀的测定。
国内尚无氟伐他汀的人体药动学报道，应用本实验建立的方法测定了12名国内健康志愿者口服40 mg氟伐他汀钠胶囊后的血浆浓度，计算所得的药动学参数与国外文献［4］报道基本一致。
［参考文献］
1 Lanchote VL， Rocha A, De Ailuquerque FU,et al. Stereoselective analysis of fluvastatin in human plasma for pharmacokinetic studies. J Chromatogr B Biomed Sci App1,2001,765（1）:81-88.
2 Nnkashima A, Saxer C, Niina M, et al. Determination of fluvastatin and its five metabolites in human plasma using simple gradient reversed-phase high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection. J Chromatogr B Biomed Sci App1,2001,760（1）:17-25.
3 Toreson H, Eriksson BM. Determination of fluvastatin enantiomers and the racemate in human blood plasma by liquid chromatography and fluorometric detection. J Chromatogr A,1996,729（1-2）:13-18.
4 Barilla D, Prasad P, Hubert M, et al. Steady-state pharmacokinetics of fluvastatin in healthy subjects following a new extended release fluvastatin tablet,Lescol XL. Biopharm Drug Dispos,2004,25（2）:51-59.
作者单位： 1 410013 湖南长沙，湖南省肿瘤医院药剂科
2 410013 湖南长沙，中南大学湘雅三医院药剂科
3 410008 湖南长沙，中南大学湘雅医院药剂科
（编辑：田 雨）