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［摘要］ 目的 探讨低能量激光照射联合龙葵多糖对荷肝癌小鼠肿瘤增殖的影响。方法 建立荷肝癌小鼠皮下种植瘤模型，将荷瘤小鼠随机分为5组，连续治疗10天后将小鼠处死。原位杂交法检测瘤组织血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达；免疫组化法检测瘤组织中细胞增殖核抗原Ki 67的表达。结果 低能量激光照射联合龙葵多糖可以抑制肿瘤细胞增殖及血管生成，显著下调VEGF mRNA 、Ki 67的表达。结论 低能量激光照射联合龙葵多糖能抑制肿瘤细胞的增殖及血管生成、抑制荷肝癌小鼠肿瘤的生长。
［关键词］ 低能量激光照射；龙葵多糖； 增殖
Effects of laser irradiation solanum nigtum polysaccharide on tumor growth in cancer loaded mice
NIE Qiao-zhen, HAN Yi-lin, SU Xiu-lan.The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College, Inner Mongolia,Hohhot 010050, China
［Abstract］ Objective To study effects of low energy laser irradiation combined solanum nigtum polysaccarides on tumor growth in liver cancer loaded mice.Methods Established liver cancer loaded mouse model and divided randomly mice into five groups.Then calculated the tumor inhibitory rate and spleen index. We detected the expression of VEGF mRNA by in situ hybridization and Ki 67 protein by immune histochemistry.Results Low energy laser irradiation combined solanum nigtum polysaccharide could inhibit tumor growth and angiogenesis, the expression of VEGFmRNA, Ki 67 protein were decreased.Conclusion Low energy laser irradiation combined solanum nigtum polysaccharide can obviously inhibit the proliferation of liver cancer cells and angiogenesis ，so inhibit the growth of the liver cancer in mice.
［Key words］ low energy laser irradiation；solanum nigtum polysaccharide；cells proliferation
本实验用低能量激光照射联合龙葵多糖来治疗荷瘤小鼠，观察其对肿瘤细胞增殖及血管生成的影响，以期探讨低能量激光照射联合龙葵多糖抑瘤作用的机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验药物的配制 龙葵多糖：用纯度为100%的龙葵多糖200 mg溶于生理盐水50 ml中，过滤除菌，4 ℃ 保存。5-氟尿嘧啶（Fluorouracilum ,5-FU）：0.25 g/10ml，南通制药总厂生产。
1.1.2 细胞株 肝癌细胞H-22由北京大学肿瘤研究所引进。
1.1.3 实验动物 昆明种小鼠50只，内蒙古大学动物实验中心购买。鼠龄为 4~5 wk，体重18~22 g，雌雄各半。
1.2 实验方法
1.2.1 肝癌细胞系复苏培养 将肝癌细胞H-22复苏, 收集细胞放入生理盐水1 ml中混匀，并等分两份，取2只小鼠，每只腹腔注射肝癌细胞0.5 ml进行培养，1周后取小鼠腹水制备模型。
1.2.2 制备小鼠皮下荷瘤模型 取肝癌小鼠腹水约10 ml，用生理盐水按1：2稀释成细胞悬液，调节细胞浓度为2.5×107个/ml，按0.2 ml/只接种于小鼠右腋皮下，将50只小鼠随机分为五组。（1）NS组：0.5 ml/（只·天）灌胃。 （2）低能量激光照射组：激光照射小鼠10 min/（只·天）、剂量25.48 J/（cm2·只·天）。（3）龙葵多糖组：2 mg /0.5 ml/（只·天）灌胃。（4）低能量激光照射联合龙葵多糖组：激光照射小鼠10 min/（只·天）、剂量25.48 J/（cm2·只·天）、龙葵多糖2 mg/（0.5ml·只·天）灌胃。（5）5-FU组：0.25 mg/（0.5 ml·只·天）灌胃。采用南京激光仪器厂产JD-Ⅲ型激光器，输出功率12 mW，波长632.8 nm，光斑直径0.6 cm。从接种瘤细胞24 h后（2）、（4）组用激光照射小鼠脾区（脱毛），激光照射距离30 cm，每日1次，每次照射10 min，同时各药物组相应灌胃给药，照射、给药10次结束后24 h处死小鼠。
1.2.3 病理组织学观察 处死荷瘤鼠后30 min内取瘤组织、脾脏等脏器，10%中性甲醛固定后，常规石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，光学显微镜下低倍、高倍观察。
1.2.4 原位杂交法检测瘤细胞VEGF mRNA表达 采用VEGF mRNA原位杂交试剂盒，检测瘤组织VEGF mRNA表达。
1.2.5 免疫组化法检测瘤组织Ki 67抗原表达 采用免疫组化S-P法检测。按照试剂盒说明书进行操作。
1.3 统计学方法 实验数据应用SPSS 13.0软件统计，多组间比较采用方差分析,组间两两比较用q检验。
2 结果
2.1 肿瘤组织切片光镜观察 NS组肿瘤细胞数增多，呈异质性，核大深染，出现较多核分裂象，可见血管形成增多。激光照射联合龙葵多糖组瘤细胞减少，细胞体积缩小，有较多的核固缩，淋巴细胞浸润，血管形成明显减少。
2.2 原位杂交法检测瘤细胞VEGF mRNA的表达 VEGF mRNA阳性反应胞浆呈棕黄色。图像分析系统对各组瘤细胞VEGF mRNA表达进行平均灰度值统计。结果显示激光照射联合龙葵多糖组较NS组明显减弱，联合组与激光照射组、龙葵多糖组相比也有所减弱。见表1。表1 瘤细胞中VEGF mRNA阳性表达的平均灰度值统计注：与NS组相比，▲P＜0.01；与激光联合龙葵多糖组相比，●P＜0.05
2.3 免疫组化法检测瘤细胞Ki 67表达 计数采用Ki 67指数［1］ ,即每个标本低倍镜 （×100）下观察,选择5个视野;高倍镜 （×400）下每个视野选取200个肿瘤细胞,计算其阳性细胞总数。Ki 67阳性为细胞核染色呈棕黄色, 阴性对照片（PBS为一抗）无棕黄色着色。实验组与NS组相比Ki 67值明显减少，联合组与龙葵多糖组、激光照射组相比也明显减少。见表2表2 各组小鼠肿瘤细胞Ki 67指数 注：与生理盐水组比较，▲P＜0.01；与激光联合龙葵多糖组比较，●P＜0.05
3 讨论
激光照射部位越接近免疫器官,或该处神经组织越密集,对机体免疫功能影响就越为明显［2］。从龙葵中提取的抗癌活性物质龙葵多糖有较好的抑瘤作用，本研究应用龙葵多糖与激光的生物学疗法联合作用来提高抗肿瘤效果。
肿瘤血管形成在肿瘤的演化过程中起着非常重要的作用，肿瘤通过血管从宿主获得丰富的营养和氧，并通过血管向宿主输送大量恶性细胞，导致肿瘤的不断生长和转移，因此肿瘤血管新生是恶性肿瘤生长和转移的前提。在较多诱导实体肿瘤血管生长的因子中，血管内皮生长因子（VEGF）被认为是最重要的血管形成因子，也是高度特异和高效的血管调控因子，多种实体瘤细胞分泌VEGF，诱导肿瘤血管形成，与肿瘤的生长、转移密切相关［3］。VEGF是一种多功能细胞因子,能选择性地作用于血管内皮细胞膜上的两种酪氨酸激酶受体,具有促进内皮细胞分裂、增殖和血管构建的作用，能够提高微血管对大分子物质的通透性，诱导内皮细胞产生蛋白溶酶、诱导间质胶原酶和组织因子的表达，改变细胞外基质，使其更易于血管的生长［4］。本实验结果表明低能量激光照射联合龙葵多糖可以抑制肿瘤细胞中VEGF的生成，导致血管生成的环节受到抑制，肿瘤组织血管生成减少，阻断肿瘤生长所需营养，抑制肿瘤细胞生长、侵袭、转移。
细胞增殖抗原Ki 67是目前应用最广泛的增殖细胞标记抗原之一, 是和细胞周期相关的增殖细胞核抗原，表达于细胞核内，能很好地反映细胞增殖活性，其检测结果较半衰期较长的PCNA更准确［5］。本实验结果表明未给予任何抗癌药物的NS组瘤细胞Ki 67表达增强，细胞增殖活性增高，瘤组织增殖旺盛。激光照射联合多糖组瘤细胞Ki 67表达减弱，瘤细胞增殖受到抑制，导致肿瘤的生长被抑制。
总之，低能量激光照射联合龙葵多糖能够减少肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞增殖。关于激光和龙葵多糖抑瘤作用的研究还不够深入,许多问题还有待于进一步研究。
［参考文献］
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4 Yoshiji H, Kuriyama S, Hicklin DJ, et al. The vascular endothelial growth factor receptor KDR/Flk-1 is a major regulator of malignant ascites formation in the mouse hepatocellular carcinoma mode. Hepatology, 2001，33（4）:841-847.
5 卢德宏，董彬，徐庆中,等. 细胞增殖周期的调控及其抗调控因子抗体在肿瘤病理学研究中的应用. 诊断病理学杂志，1996，3：61-65.
作者单位： 1 010050内蒙古呼和浩特，内蒙古医学院附属医院理疗科（*中心实验室）
2 010059内蒙古呼和浩特，内蒙古医学院组胚教研室
（编辑：田 雨）