尖锐湿疣患者外周血T淋巴细胞亚群与局部细胞 免疫功能的相关性研究

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    ［摘要］  目的  研究尖锐湿疣（condyloma acuminatum,CA）患者外周血T细胞亚群（CD4+、CD8+）及皮损局部T细胞亚群（CD4+、CD8+）的变化及二者的相关性。

    方法  应用流式细胞仪检测42例CA患者及30例正常对照者外周血T细胞亚群（CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）的百分比；同时用免疫组织化学S-P法对尖锐湿疣患者皮损的表、真皮T细胞亚群进行测定。

    结果  CA组外周血CD4+T细胞表达率（25.21±5.77）%明显低于正常对照组（35.05±3.06）%，CD8+T细胞表达率（39.34±7.46）%，显著高于正常对照组（26.39±2.32）%，二者均具有非常显著性差异（P＜0.01），CD4+/CD8+比值患者组（0.67±0.26）显著低于正常对照组（1.35±0.19）（P＜0.01）；且CA组真皮每高倍视野中CD4+T细胞表达（185.39±31.69）明显高于正常对照组CD4+T细胞（60.64±9.11）（P＜0.01），CA组CD8+T细胞表达（228.86±33.26）显著高于正常对照组（35.59±6.17）（P＜0.01），CA组CD4+/CD8+的比值（0.81±0.10）显著低于正常对照组（1.73±0.25）（P＜0.01）；经统计学分析CA患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞的变化与皮损局部的CD4+T细胞、CD8+T细胞的变化尚不能认为有相关性（P＞0.05）。

    结论  CA患者存在细胞免疫功能降低，CA的发病（包括亚临床感染、潜伏感染）、复发及再感染与机体的细胞免疫功能密切相关，从而为CA的治疗提供理论依据。

    ［关键词］  尖锐湿疣；T细胞亚群；流式细胞仪；免疫组织化学

     Peripheral T cell subset and local cytoimmune function in condyloma acuminatum

    YANG Jing.

    The Second Hospital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

    ［Abstract］  Objective  To study the changes of T cell subset （CD4+,CD8+） in both peripheral blood and partial lesions in patients with condyloma acuminatum（CA）,and the relationship.

    Methods  To describe the levels of CD4+T cell,CD8+T cell and CD4+/CD8+ in 42 patients with CA and 30 normal controls by flow cytometry;to count the numbers of T cell subset in partial lesions with CA.

    Results  The levels of CD4+ T cell，CD4+/CD8+ T cell in peripheral blood of the CA were lower than those of the controls（P＜0.01）.The level of CD8+ T cell was higher than that of the controls（P＜0.01）. And the levels of CD4+ T cell，CD8+ T cell in partial lesions of the CA were higher than those of the controls（P＜0.01）.The level of CD4+/CD8+ T cell in partial lesions of the CA was lower than that of the controls（P＜0.01）. The change of peripheral T cell subset was not related to partial lesions T cell subset in patients with CA.

    Conclusion  The cell-mediated immunodeficiency exists in patients with CA.The occurrence of CA（including subclinic infection,latent infection）,recrudescence and reinfection were associated with the cell-mediated immunity,which provided the guide for the therapy of CA.

    ［Key words］  condyloma acuminatum；T cell subset；flow cytometry；immunohistochemistry

    尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）又称尖圭湿疣、生殖器疣（genital warts）或性病疣（venereal warts），是由人类乳头瘤病毒（HPV）引起的多发于肛门生殖器部位的增生性疾病，也是一种常见的病毒性性传播疾病（STD）。常见的HPV有6、11、16、18型等，虽然研究表明引起尖锐湿疣的HPV主要是6型和11型［1］，但郭华阳等检测24例复发性尖锐湿疣皮损HPV发现，HPV 16型检出率较高［2］。HPV 16、18在宫颈上皮内瘤样病变Ⅱ~Ⅲ级和宫颈癌中检出率较高，属于高危型。

    在我国尖锐湿疣的发病率在逐年上升，现已位居性传播疾病的第二位［3］。尖锐湿疣患者主要为青壮年，女性发病率高于男性，绝大多数传染与性行为有关。

    尖锐湿疣的传染源是本病患者、亚临床感染者和带病毒者，在患者病灶的分泌物、白带和精液中都含有人乳头瘤病毒，人与之接触即可发生感染。

    Morison和Larcone［4,5］均认为尖锐湿疣的形成、发展与机体细胞免疫功能的改变有密切关系。在HPV感染的各个阶段，机体免疫功能均受到HPV病毒的抑制。即HPV病毒可通过不同的方式破坏免疫细胞，诱导抑制性细胞，产生抑制因子等以降低机体的免疫应答，使之出现病毒的持续性感染［6］。目前认为，外周血T淋巴细胞及其亚群是反映细胞免疫功能最敏感的指标［7,8］。Cauda等报道［9］，尖锐湿疣患者外周血T淋巴细胞亚群异常，Ts升高，Th/Ts比值降低。而尖锐湿疣皮损局部的细胞免疫的变化情况目前国内外的相关报道不多。

    本文采用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群，用免疫组化的方法检测尖锐湿疣皮损组织中T淋巴细胞亚群的变化情况，并探讨二者的关系及机体的免疫状况，为尖锐湿疣的临床防治及其预后提供理论依据。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料  42例尖锐湿疣患者均来自我院皮肤性病科门诊，所有病例均符合卫生部防疫司1991年制定的CA诊断标准。其中男25例，女17例，年龄18~56岁，平均（32.12±8.09）岁；病程1周~12个月，平均4.3个月，全部病例就诊前均未接受过任何治疗（包括激素及免疫调节剂），不合并其他性传播疾病及严重的内脏疾病。外周血正常对照组30例，取自健康体检者，其中男13例，女17例，年龄12~63岁，平均（35.17±13.28）岁；皮肤对照组30例，取自包皮环切术后，年龄8~45岁，平均（23.63±8.36）岁。

    1.2  试验方法

    1.2.1  标本采集  肘静脉采血2 ml至抗凝管中；2％利多卡因注射液局麻手术切除0.5 cm大小皮损。

    1.2.2  试剂  外周血CD4+T细胞,CD8+T细胞抗体（CD4+FITC/CD8+PE）购自法国IMMUNOTECH公司。

    免疫组化CD4+T细胞,CD8+T细胞抗体购自福建迈新生物技术开发公司。

    CD4+T细胞抗体为鼠抗人单克隆抗体（编号MAB－0251），工作浓度1∶20，CD8+T细胞抗体为鼠抗人单克隆抗体（编号MAB－0021），为工作即用型。SP试剂盒为福建迈新公司产品。

    1.2.3  流式细胞仪分析  采用美国COULTER公司生产的流式细胞仪。

    1.2.4  免疫组化  福尔马林浸泡组织，常规石蜡包埋组织，切片厚5 μm。石蜡脱水 3％双氧水室温孵育10 min以消除内源性过氧化物酶的活性。

    蒸馏水洗涤5 min。PBS液洗涤3遍。CD4+T细胞用EDTA进行抗原修复，CD8+T细胞用枸橼酸热修复。血清封闭20 min。倾去血清，分别加一抗，4 ℃过夜。室温放置30 min。

    PBS冲洗，5 min×3次。滴加二抗，37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。滴加三抗，37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。DAB显色。自来水充分冲洗，复染，封片。

    1.2.5  统计学方法  应用SPSS 10.0统计软件进行分析。两样本均数比较采用t检验，两组指标间做相关分析。

    1.3  结果判定  流式细胞：计数每1万个细胞中标记细胞的百分比。免疫组化：以细胞膜出现棕黄色染色为阳性细胞。独立观察每张切片5个具有代表性的高表达视野，分别计数每个高倍镜视野下阳性细胞的数量，计算均数和标准差。

    2  结果

    2.1  外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达  见表1。表1  外周血T淋巴细胞亚群检测结果 注：各组两两比较，*P＜0.01 与正常对照组比较，CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值均降低（P＜0.01），CD8+T细胞升高（P＜0.01）。

    2.2  尖锐湿疣患者CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达  试验结果显示，尖锐湿疣患者表皮中出现CD4+T细胞、CD8+T细胞分别为37.66±5.77、75.65±20.00，CD4+/CD8+的值为0.50±0.12。

    2.3  尖锐湿疣患者真皮CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达  见表2。表2  真皮CD4+、CD8+的检测结果注：各组两两比较,*P＜0.01

    试验结果为尖锐湿疣患者真皮中CD4+T细胞、CD8+T细胞数目较正常对照为高，而CD4+/CD8+比值下降（P＜0.01）。

    2.4  相关性分析  尖锐湿疣患者外周血T细胞亚群百分比的变化与皮损局部T细胞亚群数目的变化经统计学相关分析显示P＞0.05，尚不能认为二者有相关关系。

    3  讨论

    尖锐湿疣的感染分为三种，即潜伏（隐性）感染、亚临床感染、尖锐湿疣，系一个疾病的谱系变化，其中亚临床感染为过渡期，可向其他两种状况演变，这主要取决于机体的免疫功能。

    本病与生殖器癌的发生有一定关系，有较多的研究显示HPV的高危变异亚型HPV16/18［10,11］可破坏宿主的免疫系统，使病毒持续存在［12］,最终导致感染组织恶化［13］,已引起国内外学者的高度重视。

    近年来的研究表明50%的性活跃成人曾感染过一种甚至多种HPV，其中大多数为未被临床诊断的HPV亚临床感染，可通过性接触传染或垂直传播。尖锐湿疣患者中约有2/3的性伴会发生尖锐湿疣，其潜伏期平均为2~3个月。

    现已证明，机体免疫功能特别是细胞免疫在控制HPV病毒的激活和消退以及对治疗的反应方面起着重要的调节作用。尖锐湿疣的迁延不愈和顽固难治与HPV逃避机体的免疫监视有关［14］。尖锐湿疣的HPV潜伏感染和亚临床感染是导致临床漏诊、造成性伴间HPV感染以及尖锐湿疣复发不可忽视的重要因素。

    国内外诸多研究显示，尖锐湿疣患者细胞免疫和体液免疫都有不同程度的改变，但目前研究最多的是尖锐湿疣的细胞免疫，多数学者认为细胞免疫与尖锐湿疣的发病有密切关系。

    笔者应用流式细胞仪测定了42例尖锐湿疣患者T淋巴细胞亚群后发现：CD4+T细胞百分率、CD4+/CD8+（免疫调节指数）的比值均明显降低（P＜0.01），CD8+T细胞百分率增高（P＜0.01），这与国内外的报道一致［15］。许多学者认为机体对尖锐湿疣的特异性免疫是细胞免疫，尖锐湿疣患者存在细胞免疫抑制现象，致使外周血T细胞亚群失衡［16］。本试验结果显示，辅助性T细胞减少、抑制性T细胞增加，表明尖锐湿疣患者细胞免疫功能受到抑制。由于辅助和促进细胞免疫反应的T细胞减少，造成机体抗病毒的免疫应答受到抑制。其原因可能是由于HPV病毒感染后攻击机体免疫系统，引起一系列免疫反应，包括自然杀伤细胞（NK）、朗格罕细胞（LC）及各种细胞因子（白细胞介素-2即IL-2、可溶性白细胞介素受体即SIL-2R、白细胞介素-10即IL-10和白细胞介素-12即IL-12）综合作用导致抑制性CD8+T细胞增多、CD4+T细胞减少、CD4+/CD8+降低。

    多数学者认为HPV病毒感染导致了CA患者机体内细胞免疫功能发生紊乱，也有学者认为尖锐湿疣患者在感染HPV前是否存在细胞免疫功能缺陷还是因机体感染HPV导致免疫抑制并不十分明了。

    T细胞比例失调导致体内一系列细胞免疫反应抑制效应（包括在病毒特异性抗原早期感染时不能有效启动TH1型细胞对病毒抗原的应答反应以及增强T细胞和NK细胞活性）在CA发病机制中起重要作用［17］。

    HPV感染后，局部皮肤的表皮与真皮中有大量的以淋巴细胞为主的细胞浸润，本试验对42例患者局部皮损的检测发现CD4+T细胞、CD8+T细胞在真皮及表皮中均增高，但以CD8+T细胞增高的更为显著，说明尖锐湿疣患者皮损局部存在细胞免疫的抑制。这与Morelli的报道一致。Morelli等发现CA组织中有中至重度单核细胞浸润，浸润细胞以T细胞为主［18］。

    Coleman［19］等认为，感染HPV的生殖器皮损处真表皮内有大量CD3 T细胞浸润，CD4+/CD8+比值下降，表皮中CD8+T细胞密度高于CD4+T细胞，这与本试验结果相同，但他们认为真皮中CD4+T细胞密度高于CD8+T细胞，此与本结果不符。有研究表明，除T细胞外在真皮基质中还有大量的巨噬细胞以及B细胞、大颗粒淋巴细胞、自然杀伤（NK）细胞。真皮中T细胞浸润主要位于靠近基底膜的基质中或真皮毛细血管和小静脉周围。

    局部免疫检测显示表皮中CD4+T细胞对B细胞产生抗体的辅助作用及T细胞、B细胞相互作用时所产生的诱导作用相对减弱，这种局部免疫应答的抑制状态有利于尖锐湿疣的发生和发展。Coleman等研究了尖锐湿疣自发性消退中损害与无消退迹象损害中的免疫细胞，结果发现正在消退中的尖锐湿疣损害内T细胞总数和表皮中T淋巴细胞和巨噬细胞明显增加，CD4+T细胞明显增加，CD4+/CD8+细胞比值均高于无消退的尖锐湿疣损害，从而为尖锐湿疣患者采用免疫增强剂治疗提供了理论依据。

    尖锐湿疣皮损局部细胞免疫功能缺陷形成机制众说纷纭，但总体上讲是一个相当复杂的过程［20］，涉及抗原的递呈，淋巴细胞的激活及增殖，黏附分子和细胞因子的表达，效应细胞如CTL与HPV感染的角质形成细胞发生相互作用障碍等多个环节，既有免疫功能总体水平低下，又有免疫调节紊乱、免疫平衡的失调。

    本试验对42例尖锐湿疣患者的外周血和皮损局部CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD4+/CD8+比值的变化分别进行相关性分析，结果显示，两者差异无统计学意义。由此推论外周血T细胞免疫反应和患者局部T细胞免疫反应的变化无相关性。这可能与以下几点有关：（1）外周血免疫反应较敏感，而皮损局部反应较慢。（2）检测手段的差异。（3）地域、种族的差异。目前对外周血和局部细胞免疫反应的相关性研究还未见报道，尚有待扩大样本例数进一步证实。

    本研究结果显示，尖锐湿疣患者组外周血T细胞亚群CD4+T细胞、CD4+/CD8+降低，CD8+T细胞增高与正常对照差异有显著性；尖锐湿疣患者皮损表皮中出现CD4+T细胞、CD8+T细胞，以CD8+T细胞增高为著，真皮中CD4+T细胞、CD8+T细胞均增高，CD4+/CD8+比值降低，与对照组比较均差异有显著性。而尖锐湿疣患者外周血T细胞亚群的变化和皮损局部T细胞亚群变化的相关性研究发现两组差异无统计学意义。提示：尖锐湿疣的发病（包括亚临床感染、潜伏感染）、复发及再感染与机体的细胞免疫功能有密切关系。只有提高机体的免疫功能，HPV病毒才能消失，从而影响尖锐湿疣的消退，为尖锐湿疣的治疗提供了理论依据。

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  作者单位： 030001 山西太原,山西医科大学第二医院皮肤性病科   （编辑：宋  青）