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Home医源资料库在线期刊中华现代临床医学杂志2006年第4卷第19期

略论PCR-DGGE技术在中草药栽培及药理研究中的应用

来源:中华现代临床医学杂志
摘要:[摘要]目的探讨PCR-DGGE技术在中草药栽培及药理研究中的应用。方法采用PCR-DGGE技术对中草药生长的不同时期或不同土壤环境中的微生物群落的结构组成进行检测,分析环境中微生物种类、组成比例等因素的影响,同时配合其他指标的检测。结果中草药药理的研究较前可以更加透彻、深入。结论该技术在药物栽培和药理研究......

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  [摘要]  目的  探讨PCR-DGGE技术在中草药栽培及药理研究中的应用。方法  采用PCR-DGGE技术对中草药生长的不同时期或不同土壤环境中的微生物群落的结构组成进行检测,分析环境中微生物种类、组成比例等因素的影响,同时配合其他指标的检测。结果  中草药药理的研究较前可以更加透彻、深入。结论  该技术在药物栽培和药理研究领域中应用的前景十分广阔。

  [关键词]  PCR-DGGE; 中草药药理;中草药栽培;环境微生物
   
  中国传统医学历史悠久,既是中华五千年文明之瑰宝,亦是世界医药花园中的奇葩。其中中草药是中医治疗中最为重要的应用手段之一,中草药与几乎中医学的治疗过程都密不可分。而中草药的药理学特性更是中药研究的核心。但很多药材,甚至可以说大多数药材的药理学特性并没有被完全的掌握,尤其是一些稀有的药材。这些药材之所以稀有和珍贵,根本原因在于它们不能够进行移栽或人工培养,强行进行移栽,只会使它们的药理学或者是生理学特性发生改变,因此,为疾病的中医治疗带来了困难。中草药的药理学特性的产生其实与其所生长的环境条件密不可分。温度、水分、光照、土壤成分等很多因素都会对其生长产生影响,但即使这些环境条件都满足的情况下,某些药材的移栽和人工培养仍然不能够成功,其原因极有可能是环境中微生物因素造成的。微生物因素亦会对药材的药理学特性产生重要的影响。而土壤环境中微生物因素的影响在过去的技术水平下,是很难完全研究清楚的。因此,相信这也是中药栽培以及药理产生研究的重要障碍。变形梯度凝胶电泳技术(DGGE)是在含有浓度线性递增的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳中,将长度相同的双链DNA因其碱基排列的不同而分离[1]。即通过因不同微生物的DNA分子结构的差异使不同微生物的特异性DNA条带分开,再经过分析、割胶回收条带、测序、序列搜索比对等步骤测定环境中微生物种类、优势组成、数量比例等项目,进行环境微生物研究。从1993年开始将DGGE 应用微生物生态学研究,DGGE技术便迅速的发展起来,这项技术应用于微生物生态学只有10多年历史,目前却被广泛应用于环境微生物的检测中。
   
  DGGE技术在土壤[2]、水体[3]、发酵食品等[4]环境的微生物多样性和微生物群落变化等方面的应用,多与其他分子生物学技术(如PCR技术)手段相结合,产生了PCR-DGGE等技术。PCR-DGGE在微生物群落结构研究中,日渐发挥着巨大作用。该技术可以对中草药生长的不同时期或不同的土壤环境中的微生物群落结构组成进行检测,其操作简单,并可同时测定多个样品。假如使用该技术来作为中草药栽培以及药理学研究的辅助手段,可以使研究更加深入、透彻。本文通过研究查阅国内外大量文献资料以及结合笔者等PCR-DGGE应用技术积累的经验,针对于药材土壤环境中的微生物群落应用DGGE分析的主要步骤、常见问题试做简单介绍,以提供参考。

  1  样品处理

  DNA的产率高低直接决定DGGE条带的代表性。产率低,其条带的代表性就差。而环境样品处理的好坏,决定了DNA产率的高低。我们对于土壤样品,一般采取修改后的Bead-Beating法[5]。称取10 g土样,放入盛有数粒无菌玻璃珠(直径3~5 mm)的三角瓶中,加15 ml提取缓冲液。在180 rpm,37 ℃条件下振荡30 min,加2 ml 20%SDS继续振荡10 min。65 ℃水浴1 h后6000 g离心15 min,收集上清液,加0.5倍体积PEG (30%)-NaCl(1.6 mol/L),混匀后室温下静止2 h,在10000 g离心20 min,沉淀用 2 ml TE重新悬浮。加4 mol/L NaCl至终浓度0.3 mol/L,用酚-氯仿-异戊醇抽提1次,0.6倍体积异丙醇沉淀2 h,12000 g离心20 min,沉淀干燥后,200 μL TE溶解,经纯化后,-20 ℃保存。

  2  PCR扩增

  在PCR扩增中,引物的选择、扩增程序和PCR 产物的质量都会造成群落结构的分析偏差。因此PCR扩增效率必须保证。

  2.1  引物的选择  为完整提取环境样品中的DNA所以一般采用5’端连接了GC夹结构的通用引物,来扩增环境中微生物的16SrDNA的某一序列,引物分上游引物和下游引物两种,可以根据不同需要自行选择或设计。

  2.2  扩增程序  由于扩增的目的DNA片段的不同,扩增程序会稍有不同,但一般都是采用梯度PCR经过预变性循环、退火恒温循环、延伸等几个步骤。PCR扩增中要注意,模板DNA的量是有一个适宜范围的,质量浓度应在5 ng/μl。PCR反应体系的药品添加一定要在冰盒上进行,而且速度要快。另外,扩增时的程序选择,必须选Lid heat。

  2.3  扩增后的产物检查  可进行琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检查,因EB为致癌物质,所以目前一般选用Goldview染色、成像。

  3  DGGE

  3.1  DGGE 药品的准备  多采用双梯度法进行。即聚丙烯酰胺和变性剂为2个梯度,聚丙烯酰胺一般6~12 g/100 ml,变性剂梯度可以根据情况调整,一般在15%~60%[尿素为7 mol/L、甲酰胺为40% (体积分数) 时的变性浓度为100%]的范围内,制备胶还需要10 g/100 ml过硫酸铵以及TEMED。

  3.2  DGGE胶的制备  在DGGE整个过程中,制胶是非常关键的步骤,其步骤比较繁琐。一般要等待3 h胶才能凝固。制胶一般经过以下几个步骤:(1)擦净玻璃板;(2)组装制胶器;(3)进胶;(4)插上梳子;(5)试漏检验;(6)凝胶;(7)清洗用具。

  3.3  电泳  在胶制备好之后,可以进行电泳。

  3.4  染色及成像  多采用银染法。银染后将胶放入凝胶成像仪舱内,将胶放平整,排出多余气泡,照相。

  3.5  条带分析及回收  图像可以采用Quantity one(Bio-rad)分析软件进行分析。所得到的DNA条带可以切割下来回收并测序然后登陆NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast),将所得序列与数据库中已知序列进行比较。用Clustal X 和DNA Star 进行相似性分析。便可以得知样品中生物的种类,组成比例,微生物的基因序列有何变化等。

  3.6  结合其他生长条件指标进行该种草药药理特性产生的分析  当微生物因素的影响情况得知后,再配合土壤化学成分、温度、湿度、光照等因素的分析情况,即可进行草药生长特性及药理学特性的综合分析。

  4  PCR-DGGE在中草药药理研究中的应用前景

  PCR-GGE技术可以进行来源于环境中未培养微生物的功能基因甚至是基因组学研究,拓宽了微生物群落的研究领域[6],并可以同时分析多个样品,使该技术成为监测微生物群落动态的一种强有力的工具[7]。假如通过该项技术对药物生长土壤中微生物成分进行检测,同时对时间以及不同生长环境做横向或纵向的对比分析,那将使很多药材药理产生的原因得到更广泛、更深入的认识。把PCR-DGGE技术这种现代的生物技术应用到中药栽培以及药理学的研究,必将为祖国中药事业的发展,起到良好的推动作用。这项技术在中草药栽培或是药理研究中的应用前景非常广阔。

  [参考文献]

  1  Fischer SG,Lerman LS.Lengthin dependent separation of DNA restriction fragments in two-ditmentional gel electrophoresis.Cell,1979,16:191-200.

  2  Pedro MS,Haruta S,Hazaka M,et al.Denaturing gradient gel electrophoresis analyses of microbial community from field-scale compost.Biosci Bioeng,2001,91:159-165.

  3  Araya R,Tani K,Takagi T,et al.Bacterial activity and community composition in stream water and biofilm from an urban river determined by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysis.FEMS Microbiol Ecology,2003,43:111-119.

  4  Randazzo CL,Torriani S,Akkermans ADL,et al.Diversity,dynamics,and activity of bacterial communities during production of an artisanal sicilian cheese as evaluated by 16S rRNA analysis.Appl Environ Microbiol,2000,68:1882-1892.

  5  Yeates C,Gilling MR.Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR application.Biological Procedures Online.1998,1:40-47.

  6  邢德峰,任南琪.应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析.微生物学报,2006,46(2):331-335.

  7  邓小宽,张新宜,田敏.现代生物技术在分子微生物生态学中的应用.国外医药·抗生素分册,2006,27(4):164-170.

  作者单位: 1 150025 黑龙江哈尔滨,哈尔滨师范大学生命与环境科学学院

  2 165100 黑龙江呼玛,呼玛县人民医院

  (编辑:于秋山)

作者: 付源1,徐香玲1,付增秋2 2007-4-26
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