非接触式共培养技术在体外细胞实验中的初步应用

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    ［摘要］  目的  研究与恶性黑色素瘤细胞进行非接触式共培养的间充质干细胞表型变化，从而明确非接触式共培养体系可以应用于两种细胞之间相互作用的研究。
   
    方法  利用Transwell进行非接触式共培养，分析间充质干细胞形态变化，利用免疫组织化学与免疫荧光检测其Ⅷ因子和CD34表达。
   
    结果  间充质干细胞在非接触式共培养体系中可以被恶性黑色素瘤细胞诱导为多角形或短梭形，同时Ⅷ因子和CD34表达上调。
   
    结论  初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的间充质干细胞中部分细胞表型发生改变，明确非接触式共培养体系可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。
   
    ［关键词］  间充质干细胞；恶性黑色素瘤；非接触式共培养   
      
    Primary application of in vitro cell research by indirect coculture system
   
    ZHAO Xueming, LIU Yixin, NI Chunsheng,et al.
   
    Tianjin Medical University，Tianjin 300070,China
   
    ［Abstract］  Objective  To study the phenotype change and interactions of mouse bone marrowderived mesenchymal stem cells induced by B16, a mouse malignant melanoma cell line.
   
    Methods  Indirect coculture was based on transwell system to analyse the phenotype change of MSC. Determination of the expression of  Ⅷ factors and CD34 by immunohistochemistry and immunofluorescence.
   
    Results  MSC was form in polygon and fusiform induced by B16. Then the immunohistochemistry and immunofluorescence staining show Ⅷ factors and CD34 was upregulation of MSC.
   
    Conclusion  The results of the indirect coculture experiments with B16 cell and MSC in vitro can initially confirm that parts of the MSC transform their phenotype, it means that indirect coculture system may used in cell interaction research in vitro.
   
    ［Key words］  mesenchymal stem cells; malignant melanoma; indirect cocuuture      
   
    间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是指存在于骨髓基质中的非造血组织的另一类重要的干细胞，它最显著的生物学特征是既有自我更新的能力，又具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的潜能［1,2］。它有着广泛的来源，包括骨髓、骨骼肌、软骨、骨、肌腱等，故在干细胞研究领域中具有突出的优势及非常重要的理论研究意义和临床应用价值。
   
    笔者希望通过进行MSC细胞和恶性黑色素瘤细胞的非接触式共培养，观察不同培养条件下的MSC形态，检测多种指标免疫组织化学染色结果、分析差异，初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的MSC中部分细胞表型发生改变，明确非接触式共培养体系可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  实验动物  小鼠源性间充质干细胞，天津医科大学病理教研室。小鼠源性恶性黑色素瘤细胞B16细胞系，环湖医院细胞室。
   
    1.2  主要实验试剂  CD34，兔抗小鼠IgG多克隆抗体，Santa cruz公司，货号SC-9095。Ⅷ因子，兔抗小鼠IgG多克隆抗体，基因公司，货号GA008202。
   
    1.3  主要实验器材  倒置相差光学显微镜，Olympus公司。图像采集系统，Nikon/Dell公司。自动控制恒温培养箱，Jouan公司。Transwell，0.4 μm孔径，Costar公司。
   
    1.4  非接触式共培养体系中B16细胞对MSC细胞的诱导分化作用
   
    1.4.1  MSC细胞与B16细胞非接触式共培养实验  选取MSC细胞和B16细胞，进行细胞计数，配制成浓度为3.0×104个/ml的MSC预培养工作液和浓度为7.5×104个/ml的B16预培养工作液。将1 ml MSC预培养工作液加入对应的Transwell预培养孔中；将0.1 mlB16预培养工作液加入Transwell中的共培养插件中，再将0.6 ml培养基，沿侧壁缓缓注入下层小室，样品编号，预培养24 h后，取出Transwell培养板，将各孔及共培养插件中原有的培养液吸去，向MSC预培养孔中加入0.6 ml培养基（10%胎牛血清+约90%α-MEM+2%双抗），将装载有B16细胞的共培养插件一一对应放入MSC预培养孔中，向每个共培养插件中缓缓加入0.1 ml10%血清的培养基，完成Transwell非接触式共培养体系的装配。放入恒温孵育箱中，72 h非接触式共培养，定期观察细胞生长情况。
   
    非接触式共培养72 h后，吸净Transwell中的培养基，去除各孔中的共培养插件，PBS清洗2次，向各孔中加入4%的多聚甲醛，固定30 min，做好标记，放入-20 ℃保存，作为留取的非接触式共培养组MSC细胞免疫组织化学检测样本。
   
    1.4.2  MSC细胞对照性单独培养实验  选取MSC细胞，进行细胞计数，配制成浓度为3.0×104个/ml的对照培养MSC工作液。将1 ml单独对照培养MSC工作液加入相应的Transwell预培养孔中，样品编号，预培养24 h后，取出将Transwell培养板，将各孔及共培养插件中原有的培养液吸去，向各孔中加入1 ml培养基。放入恒温孵育箱中培养，72 h单独对照培养，定期观察细胞生长情况。
   
    单独对照培养72 h后，吸净Transwell中的培养基，PBS清洗2次，向各孔中加入4%的多聚甲醛，固定30 min，做好标记，放入-20 ℃保存，作为留取的单独对照培养MSC细胞免疫组织化学检测样本。
   
    1.4.3  非接触式共培养实验中MSC表面分子标记物的免疫组织化学检测  进行共培养和单独对照培养组中小鼠骨髓间充质干细胞的CD34和Ⅷ因子指标免疫组织化学检测。观察各孔的显色情况，光学倒置显微镜观察，并进行图像采集。实验数据以每种指标的平均阳性细胞数和平均阳性率表示。每组数值经过标准化后，应用χ2检验方法对各组间差异进行比较。
   
    2  实验结果
   
    实验中单独培养对照组可见有大量紧密贴壁生长的细胞，贴壁细胞形态主要表现为梭形细胞，胞核呈卵圆形，细胞形态较一致，为成纤维细胞样形态，呈较典型的MSC形态。非接触式共培养组部分MSC细胞光镜下为成纤维细胞样形态；部分细胞为多角形或短梭形，边界清晰，大小较均匀，胞核圆形或椭圆形，位于细胞中央，见图1和图2。      
    
    非接触式共培养体系中B16细胞对MSC细胞的诱导分化作用实验中，经对比观察单独培养对照组（表1）与非接触式共培养组（表2）中96孔MSC细胞IHC和免疫荧光结果，呈现单独培养对照组CD34阴性（阳性率4.8%），Ⅷ因子阴性（阳性率5.5%）；呈现非接触式共培养实验组CD34阳性（阳性率50.9%），Ⅷ因子阳性（阳性率42.2%），见图3～6。并应用SPSS统计软件进行χ2检验分析共培养组与对照组在CD34和Ⅷ因子这2个指标间平均阳性细胞数的差别（表3），结果表明实验组与对照组在CD34和Ⅷ因子这2个指标上差异有非常显著性（P<0.01）。
   
    表1  单独培养对照组MSC细胞两种检测指标  略

    表2  非接触式共培养组MSC细胞两种检测指标  略

    表3  共培养组与对照组MSC细胞两种检测指标表达差异　略
   
    图1  － 图6  略
   
    3  讨论
   
    本实验中培养的间充质干细胞紧密贴壁生长，形态较均一，其形态特征基本上为梭形的成纤维细胞状，符合骨髓间充质干细胞形态［3］。细胞CD34及Ⅷ因子阴性，排除了造血细胞和内皮细胞的可能性［4,5］。综合分析上述结果证明本次实验中对照组培养的细胞符合小鼠骨髓间充质干细胞的特点，是未产生分化小鼠骨髓来源间充质干细胞。
   
    血管内皮是指血管内壁覆盖的一层上皮细胞，具有许多重要标志，主要包括：Ⅷ因子关联抗原（von willebrand factor，vWF），可以由全身所有血管内皮细胞产生，检测这一因子主要用相应的抗体。vWF具有很高的特异性，通常认为它是反映内皮细胞的最好指标［6］，如人的vWF抗体对牛的内皮细胞没有交叉反应。
   
    本次实验中非接触式共培养组中MSC细胞光镜下部分细胞为多角形或短梭形；IHC和免疫荧光结果呈现CD34阳性，Ⅷ因子阳性，并且通过统计分析得到共培养组与对照组在CD34和Ⅷ因子2个指标上差异均有非常显著性（P<0.01）。以上结果初步证实与B16非接触式共培养的MSC部分细胞发生向内皮细胞方向分化。
   
    此次实验采用了非接触式共培养［7］，此种培养体系排除了以往接触式共培养的细胞混杂不利于后期观察和区分结果的弊端，细胞分类明确，变化一目了然。而且当培养体系中细胞间相互作用需要通过建立细胞间紧密连接和（或）需要采用旁分泌的作用方式时，则不会引起靶细胞变化。根据非接触式共培养体系的特点，可以进一步推测B16细胞是否通过向共同培养体系中分泌较高含量的某种或某些细胞因子对MSC产生作用，导致MSC的分化。
   
    综上所述，本研究通过体外进行的非接触式共培养实验，初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的MSC中部分细胞表型发生改变，明确非接触式共培养体系可以应用于两种细胞间相互作用及作用方式的研究。虽然，本研究还无法说明B16诱导MSC分化的具体方式以及确切机制，但是笔者认识了MSC在血管形成中的作用，以及非接触式共培养体系在研究细胞间相互作用及作用方式的重要作用。
   
    ［参考文献］
   
    1 Minguell JJ, Erices A, Conget P.Mesenchymal stem cells. Exp Biol Med，2001，226（6）:507-520.
   
    2  Friedenstein AJ, Gorskaja JF,Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradicated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol，1976，4（5）:267-274.
   
    3  Guo ZK,Yang JQ, Liu XD, et al.Biological properties of mesenchymal stem cells derived from bone marrow.Chin Med J，2001，114（6）:950-953.
   
    4  Huss R, Lange C, Weissinger EM,et al.Evidence of peripheral bloodderived,plasticadherent CD 34 （-/low）hematopoietic stem cell clones with mesenchymal stem cell characteristics. Stem Cells，2000，18（1）:252-260.
   
    5  Majumdar MK,Banks V, Peluso DP, et al.Isolation, characterization,and chondrogenic potential of human bone marrowderived multipotential stromal cells.J Cell Physiol，2000，185（1）:98-106.
   
    6  Blann AD, Taberner DA.A reliable marker of endothelial cell dysfunction.does it exist？Br J Haematol，1995，90（2）:244-248.
   
    7  Fierro FA,Sierralta WD,Epunan MJ, et al.Marrowderived mesenchymal stem cells:role in epithelial tumor cell determination. Clinical & Experimental Metastasis，2004，21（4）:313-319.

　　作者单位： 300070 天津,天津医科大学病理教研室（△通讯作者）

　　（编辑：魏  冉）