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【摘要】 目的 研究宫颈癌组织中HPV感染与细胞周期调控因子p27表达的关系及意义。方法 采用组织芯片技术制作60例宫颈癌组织芯片，同时用S-P免疫组织化学和原位分子杂交方法检测宫颈癌组织芯片中HPV、p27、p27 mRNA的表达。结果 60例宫颈癌组织中HPV、p27、p27 mRNA的阳性率分别为48.3%、38.3%、51.7%。淋巴结转移阳性宫颈癌中p27和p27 mRNA阳性率明显低于淋巴结转移阴性宫颈癌（P＜0.01）。淋巴结转移阳性宫颈癌中HPV阳性率明显高于淋巴结转移阴性宫颈癌（P＜0.05）。宫颈癌和CIN Ⅲ级宫颈上皮内瘤变组织中HPV阳性率明显高于CINⅠ级和CINⅡ级（P＜0.05）。而p27和p27 mRNA阳性率明显低于CINⅠ级和CIN Ⅱ级宫颈上皮内瘤变组织（P＜0.05）。宫颈癌中HPV与p27及p27 mRNA表达呈明显负相关（r=-0.574，P＜0.05；r=-0.612，P＜0.01）。结论 HPV感染和细胞周期调控因子p27低表达与宫颈癌密切相关。HPV感染与p27低表达有关。HPV和p27可作为评估宫颈癌预后的参考指标。应用组织芯片大规模高效检测临床组织样本是可行的，具有快速、方便、经济、准确的特点。
【关键词】 组织芯片 宫颈肿瘤 乳头状瘤病毒 细胞周期 p27
［Abstract］ Objective To investigate the relationship between cell cycle regulation factor p27 and HPV in cervical cancer tissue.Methods Sixty tissue chips of cervical cancer were made by tissue chip technique,S-P immunohistochemistry and in situ hybridization were simultaneously used to determine the expression of HPV,p27 mRNA in every tissue chip.Results Positive rates of HPV,p27,p27 mRNA in 60 cervical carcinoma tissues were 48.3%，38.3% and 51.7% respectively .Cervical cancers that had no lymphatic metastasis were found to be significantly more likely to express p27 and p27 mRNA and showed lower positive rates of HPV than that had lymphatic metastasis （P＜0.01＆P＜0.05,respectively）.The tissue of cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ （CIN Ⅲ） showed obvious higher positive rate of HPV and lower positive rates of p27 and p27 mRNA than the tissue of CIN Ⅰ and CIN Ⅱ （P＜0.05）.The expression of HPV showed obvious reverse correlation with that of p27 and p27 mRNA in the tissue of cervical cancer（r=-0.574, P＜0.05;r=-0.612，P＜0.01）.Conclusion Low expression of p27 and HPV infection are affinitive with cervical cancer and the HPV infection is due to the low expression of p27.HPV and p27 can be regarded as reference index used to estimate the prognosis of cervical cancer.
［Key words］ tissue chip;cervical cancer;papillomavirus,human;cell cycle;p27
大量资料表明，人乳头状瘤病毒（HPV）感染与女性生殖道肿瘤特别是宫颈癌的发生有密切关系，尤其是HPV16型和HPV18型与宫颈癌的关系更为密切［1］。笔者制作了60例宫颈癌组织芯片，并采用免疫组织化学及原位分子杂交技术检测HPV、p27和p27 mRNA的表达，探讨宫颈癌组织中HPV感染与细胞周期调控因子p27表达的关系及其意义。
1 材料与方法
1.1 材料 从我院病理科档案材料中选取2002～2005年石蜡包埋宫颈癌标本60例，宫颈上皮内瘤变标本30例（其中CIN Ⅰ级10例、CIN Ⅱ级10例、CIN Ⅲ级10例），其中宫颈癌淋巴结转移阳性者38例。患者年龄32～67岁，平均52.8岁。所有切片均按WHO宫颈肿瘤分类标准进行复检。
1.2 组织芯片制作［2］
1.2.1 组织芯片空白蜡块的制备 将熔化石蜡制作成4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm大小的空白蜡块，设计15×6的阵列，用打孔机根据设计打孔，孔径1.5 mm，即制成组织芯片空白蜡块。
1.2.2 组织芯片的制备 将选取的组织蜡块放在45 ℃温箱中烘5～10 min,然后用打孔针在蜡块选定部位逐个取出组织芯片，随即按预先设计放入空白蜡块中。将制成的组织芯片面朝下放在铜板上，于55 ℃温箱中放置30 min，轻压模块使组织芯片在模块中排平，组织芯片即制成。将切好的组织切片平整地粘贴于载玻片上。一个组织芯片蜡块一般可切100张4～5 μm的连续切片。
1.3 组织芯片免疫组化标记 单克隆抗HPV16/18-E6抗体（CIP5）为即用型工作液，单克隆抗p27抗体（DCS-72.F6）为即用型工作液，生物素-链霉菌卵白素检测系统（S-P）试剂盒，均购自福州迈新生物技术有限公司。3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，20%鸡蛋清封闭内源性生物素，严格按说明书步骤操作。DAB显色。PBS液代替一抗作阴性对照，以已知阳性切片作阳性对照。
1.4 原位分子杂交［3］ p27 cDNA探针及生物素标记试剂盒均为武汉博士德生物工程有限公司产品。主要实验步骤：（1）杂交前预处理；（2）暴露p27 mRNA核酸片段；（3）生物素标记的p27cDNA探针变性后同p27 mRNA杂交；（4）杂交后处理，DAB显色。上述过程均在无RNA酶条件下进行。PBS液代替探针作阴性对照，与已知阳性切片作阳性对照。
1.5 结果判断［4］ 染色阳性信号呈棕黄色，采用显微摄像计算机图像分析系统，计算组织芯片中阳性细胞和肿瘤细胞的数量。判断标准为：无阳性细胞为阴性（-）；阳性细胞<肿瘤细胞的50%者为阳性（+）；阳性细胞>肿瘤细胞的50%者为强阳性（++）。统计学分析采用χ2检验和spearman等级相关分析。
2 结果
2.1 HPV产物主要在细胞核内表达 宫颈癌组织中HPV阳性表达率48.3%，明显高于CIN Ⅰ级和 Ⅱ级宫颈上皮内瘤变组织，两者比较差异有显著性（P＜0.05）。
CIN Ⅲ级宫颈上皮内瘤变组织中HPV阳性表达率明显高于CIN Ⅰ级和 Ⅱ级，两者比较差异有显著性（P<0.05）。淋巴转移阳性宫颈癌组织中HPV阳性表达率明显高于淋巴结转移阴性者，两者比较差异有显著性（P<0.05）。
2.2 免疫组化标记结果 免疫组化标记显示p27阳性信号位于细胞核，原位分子杂交标记显示p27 mRNA定位于细胞质，少数细胞核可阳性。各类宫颈病变组织中HPV、p27和27mRNA的表达情况见表1。60例宫颈癌组织p27和p27 mRNA阳性表达率为38.3%和51.7%，明显低于CIN Ⅰ级和Ⅱ级宫颈上皮内瘤变组织（P<0.05）。CIN Ⅲ级宫颈上皮内瘤变组织中p27和p27 mRNA阳性表达率明显低于CIN Ⅰ级和Ⅱ级宫颈上皮内瘤变组织（P＜0.05）。淋巴转移阳性宫颈癌p27和p27 mRNA阳性表达率明显低于淋巴转移阴性宫颈癌（P<0.01）。 表1 宫颈病变组织中HPV、p27和p27 mRNA表达
2.3 宫颈病变组织HPV、p27、p27 mRNA阳性表达 本组宫颈癌病例中，23例p27阳性宫颈癌中有7例HPV呈阳性表达，阳性率为30.4%；而37例p27阴性宫颈癌中HPV有22例阳性表达，阳性率为59.5%；两者比较差异具有显著性（P<0.05）；31例p27 mRNA阳性宫颈癌中HPV有10例阳性表达，阳性率为32.2%；而27例p27 mRNA阴性宫颈癌中HPV有19例阳性，阳性表达率为70.3%；两者比较差异具有显著性（P>0.01）。经spearman分析，宫颈癌中HPV与p27及p27 mRNA表达呈明显负相关（r=-0.574，P＜0.05；r=-0.612，P＜0.01）。
3 讨论
组织芯片（组织微阵列）一般是指将数十至上千个小组织整齐地排放在一张载玻片上而制成的组织切片。1998年Kononen等［5］首次采用组织芯片技术将645例乳腺癌组织固定于载体上，同时进行多种基因的检测。从此众多学者开始对组织芯片技术进行研究，组织芯片技术不断发展和完善，其应用也愈来愈广泛［6，7］。大量研究结果证实组织芯片具有体积小、信息含量大、一次性实验即可获大量结果等优点。一个组织芯片蜡块可做100～200张连续切片，这样制作一个组织芯片可对上百种生物分子标记进行分析、检测，因而备受组织病理学家的重视。
笔者制作了60例宫颈癌组织芯片，外观排列整齐，较少出现皱折和掉片现象，极大节约了研究经费和时间，并获得较满意的实验结果。因此，应用组织芯片大规模高效检测临床组织样本是可行的，组织芯片技术与传统的病理学技术方法相比，具有快速、方便、经济、准确的特点，其应用前景广阔。
HPV感染是宫颈癌发生的重要原因，尤其是HPV16和HPV18型与宫颈癌的关系更为密切，HPV作用的生物学特征为表皮细胞角化不良，出现凹空细胞、双核细胞和退变细胞，与宫颈非典型增生及早期宫颈癌的病理变化相似。HPV能使体外培养的细胞发生恶变，推测HPV感染使细胞内的细胞周期调控因子表达异常，从而导致细胞癌变。研究表明p27在细胞增殖调控方面起着十分重要的作用，可通过两条途径抑制细胞周期，一方面抑制细胞周期蛋白激酶（CDK）激活，另一方面可抑制激活后cyclin-CDK复合物的活性［8，9］。p27虽然作用于整个细胞周期，但对G1期CDK的抑制作用尤其明显，可通过抑制cyclin-CDK2的活性，使细胞不能实现G1/S转换。本实验结果显示宫颈癌组织中HPV感染率为48.3%。HPV在淋巴结转移阳性宫颈癌和CIN Ⅲ级宫颈上皮内瘤变中高表达，p27在淋巴结转移阳性宫颈癌和CIN Ⅲ级宫颈上皮内瘤变中低表达，提示HPV和p27与宫颈癌密切相关，可作为评估宫颈癌预后的参考因素。宫颈癌组织中HPV与p27及p27 mRNA表达呈明显负相关，提示HPV感染与p27表达之间存在一定关系。
【参考文献】
1 Stoler MH,Rhodes CR,Whitbeck A,et al.Human papillmavirus type 16 and 18 gene expression in cervical neplasias. Human pathol,1992,23:117.
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9 Tomoda K,Kubota Y,Kato J.Degradation of the cyclin-dependrnt-kinase inhibitor p27kip1 is instigated by jabl.Nature,1999,398:160.
作者单位：330006 江西南昌，江西省人民医院预防保健科（△妇产科，△△病理科）